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本文作者：李艷嫦1孔靜月1吳九玲2王琳3任小平3劉瓊光1作者單位：1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院2.廣東省海豐縣農(nóng)業(yè)局3.廣東省農(nóng)業(yè)廳植檢站

材料與方法

1供試菌株

西瓜細(xì)菌性果斑病菌野生菌株Aac1和抗利福平菌株RifAac，均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物細(xì)菌研究室提供。

2培養(yǎng)基

Aac擴(kuò)大培養(yǎng)培養(yǎng)基（普通培養(yǎng)基）：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，瓊脂20g，水1000mL，pH7．4～7．8。Aac分離培養(yǎng)的培養(yǎng)基：參照改良ASCM培養(yǎng)基［11］并略作修改。KH2PO40．5g，K2HPO4•12H2O2g，（NH4）2SO42g，酵母膏10g，MgSO4•12H2O29mg，CaCl251mg，Na2MoO4•2H2O25mg，瓊脂20g，水1000mL，滅菌后每1L培養(yǎng)基中加入溴甲酚紫0．6mL（15mg／mL），氨芐青霉素20mg，新生霉素10mg，放線菌酮25mg，無水乙醇10mL，pH7．0～7．2。Aac富集培養(yǎng)基（普通液體培養(yǎng)基）：除不含瓊脂外，其成分與普通培養(yǎng)基相同。牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉NaCl5g，蒸餾水1000mL，pH7．4～7．8。

3人工模擬接種

1）健康種子。將新紅寶西瓜品種的健康種子（由廣東省農(nóng)業(yè)廳提供）分成3等份，每份500粒，取2等份浸入1×109cfu／mL的抗利福平RifAac菌液中1h，在自然條下室內(nèi)晾干后，分別轉(zhuǎn)入滅菌膠袋中，1份接菌的種子放置在室溫下，另1份接菌種子置于4℃冰箱保存；接無菌水的那份種子也置于4℃冰箱保存，作為陰性對(duì)照。定期分離和檢測(cè)種子上Aac存活情況。2）土壤。將種植過水稻、番茄、煙草和塘泥等不同來源的普通土壤各5kg均勻混在一起，經(jīng)PCR檢測(cè)不帶西瓜果斑病菌Aac，將混合土裝入潔凈盆缽中，每盆裝土15kg。設(shè)無病殘?bào)w土壤和有病殘?bào)w土壤（每盆埋入新紅寶西瓜藤和瓜皮約500g）。將活化后并培養(yǎng)48h的RifAac菌液，調(diào)整菌液濃度約1×109cfu／mL，2009年9月30日進(jìn)行人工接種。每盆接種200mL菌液，以不接菌為對(duì)照，隨后淋自來水使土壤保持濕潤(rùn)狀態(tài)。3）田水。田水取自室內(nèi)盆栽水稻盆缽中的水，摻入自來水，每盆10kg田水，接種200mL菌液。將接種后的盆缽置于露天開放的自然環(huán)境中，期間定期澆自來水，以保持土壤一定濕度。定期分離和檢測(cè)土壤里Aac存活情況。

4Aac的分離

分別采用直接分離、菌落PCR和常規(guī)PCR3種方法對(duì)人工接種的Aac進(jìn)行檢測(cè)，若能直接分離出Aac，則不進(jìn)行富集培養(yǎng)；若不能直接分離出Aac，則進(jìn)行富集培養(yǎng)后再分離，獲得的單菌落進(jìn)行菌落PCR（Bio－PCR）；若富集培養(yǎng)后無法再分離得到目標(biāo)菌，則提取樣品DNA進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè)。定期分別取人工接種的種子10g、土壤10g和水10mL，研缽內(nèi)碾碎后，加入100mL無菌水，進(jìn)行10倍梯度稀釋，各取50μL均勻涂布于含100μg／mL利福平的ASCM選擇性平板上，30℃下培養(yǎng)3～4d，觀察RifAac菌株生長(zhǎng)情況。如果直接分離不到病菌，則先將樣品于Aac富集培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，再用選擇性平板分離。將上述選擇性平板上獲得的單菌落進(jìn)一步PCR驗(yàn)證。

5Aac的PCR檢測(cè)

菌落PCR和常規(guī)PCR采用Aac的特異引物分別為WFB1（5′－GACCAGCCACACTGGGAC－3′）和WFB2（5′－CTGCCGTACTCCAGCGAT－3′）［12］，PCR片段大小為360bp。西瓜種子DNA、土壤DNA和田水DNA的提取采用試劑盒方法進(jìn)行，試劑盒PowerSoilTMDNAIsolationKit購(gòu)自MOBIO公司。TaqReactionBuffer10×（2．5U／μL），TaqDNAPolymerase（2．5U／μL），dNTPMixture（2．5mmol／L），購(gòu)于天根生化科技有限公司。采用25μL的PCR反應(yīng)體系：10×PCRBuffer2．5μL，dNTPs2μL，WFB1引物1μL，WFB2引物1μL，模板1μL，Taq酶0．4μL，ddH2O17．1μL。反應(yīng)條件：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物在1．0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。

結(jié)果與分析

1Aac在種子上的存活期

采用人工接種抗利福平RifAac菌株，每隔1個(gè)月左右對(duì)種子進(jìn)行選擇性平板直接分離、Bio－PCR以及提取種子DNA檢測(cè)，以確定種子中的Aac存活情況。RifAac菌株在含利福平的改良ASCM培養(yǎng)基選擇性平板上的菌落灰白色、圓形、光滑、隆起、不透明，直徑1～2mm。分離結(jié)果表明，接種90d后，采用選擇性平板能分離出Aac（表1），接種120d直接分離不到Aac，但富集培養(yǎng)后菌落PCR能檢測(cè)到病菌（圖1），150d后室溫保存的種子3種方法都檢測(cè)不出Aac，而低溫保存的種子只有種子DNA能檢測(cè)出（圖2），180d后常規(guī)PCR檢測(cè)不到Aac，說明在低溫條件下保存種子中的病原細(xì)菌存活時(shí)間比室溫長(zhǎng)，至少能存活4個(gè)月。

2Aac在土壤和田水中的存活期

1）分離檢測(cè)。直接分離法從模擬接種土壤、病殘?bào)w土壤和田水3種場(chǎng)所中分離，并在ASCM選擇性培養(yǎng)基上獲得的疑似單菌落，通過PCR檢測(cè)驗(yàn)證，證實(shí)為Aac活菌。結(jié)果表明，田水中1個(gè)月后直接分離不到Aac，2個(gè)月后Bio－PCR能檢測(cè)到，3個(gè)月后，田水中PCR檢測(cè)不到病菌。接種后3個(gè)月的病殘?bào)w土壤和無殘?bào)w土壤中都能分離到Aac，4個(gè)月Bio－PCR能檢測(cè)到Aac。2）PCR檢測(cè)。由于Aac在自然環(huán)境中易受環(huán)境因素和其他微生物的影響，人工模擬接種后，Aac在3個(gè)月后數(shù)量減少，用常規(guī)分離培養(yǎng)方法靈敏度有限，無法直接分離或富集分離出目標(biāo)菌Aac，因此，本試驗(yàn)進(jìn)一步選用靈敏度更高的PCR檢測(cè)方法，觀察Aac在環(huán)境中的存活情況。采用試劑盒方法提取土壤細(xì)菌總DNA，用Aac特異性引物PCR檢測(cè)不同場(chǎng)所中Aac的存活情況。從接種后的第4個(gè)月起，提取供試土壤DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，接種后第8個(gè)月沒有病殘?bào)w的土壤中仍然檢測(cè)到Aac，在第10個(gè)月則檢測(cè)不到；在接種含病殘?bào)w的土壤中12個(gè)月之內(nèi)均能檢測(cè)到Aac，表明Aac在病殘?bào)w土壤中的存活期更長(zhǎng)，至少可達(dá)12個(gè)月，帶菌土壤中的Aac存活期可長(zhǎng)達(dá)8個(gè)月（圖3）。

討論

大量的研究結(jié)果表明，西瓜細(xì)菌性果斑病主要通過種子傳播，因而病害防治的策略重點(diǎn)應(yīng)在選用無病種子或種子處理［13－14］。盡管如此，西瓜種子的藥劑處理除了存在環(huán)境污染外，仍然不能完全清除種子上的病原菌［14－16］。Shirakawa等［17］認(rèn)為，如果西瓜種子中只要有1個(gè)菌落形成單位的Aac，在適宜的環(huán)境條件下就可以導(dǎo)致幼苗的發(fā)病，因此明確病原細(xì)菌在種子上的存活期，對(duì)于指導(dǎo)種子處理具有重要參考價(jià)值。本試驗(yàn)通過篩選抗利福平的RifAac菌株，人工接種西瓜種子，定期檢測(cè)不同環(huán)境條件下病原菌在種子中的存活情況。結(jié)果表明，接菌30、60、90d后，直接分離、Bio－PCR都能在西瓜種子中檢測(cè)出Aac，但接菌120d后，只有Bio－PCR和提取種子DNA的方法才能檢測(cè)出Aac，150d后室溫和低溫保存的種子Bio－PCR都檢測(cè)不到Aac，但低溫保存的種子DNA能夠用PCR檢測(cè)出Aac，說明Aac在種子上常溫下至少可以存活4個(gè)月，4℃低溫下至少可存活5個(gè)月。然而，Shirakawa等［17］的研究結(jié)果表明，Aac在種子中4℃下可以存活更長(zhǎng)時(shí)間，其原因可能是由于研究方法和取樣的不同所致。Shirakawa等觀察的是田間感染了病菌的種子，病原細(xì)菌可能已經(jīng)侵入到種子內(nèi)部；本試驗(yàn)是通過人工接種，病菌可能都在種子表面，其存活期可能沒有在種子內(nèi)部時(shí)間長(zhǎng)，這個(gè)推測(cè)尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。此外，帶菌的種子散落在田間后，長(zhǎng)出的西瓜植株、殘留在田間的染病瓜皮和田間可能帶菌的葫蘆科雜草等，都是感染下茬西瓜的重要菌源［2］，但該病菌是否可以在其他雜草或土壤中殘存，其存活期的長(zhǎng)短還不清楚。盡管有文獻(xiàn)記載，病菌在埋土中的西瓜皮上可存活8個(gè)月，在病殘?bào)w上可存活24個(gè)月［18］，但缺乏試驗(yàn)證明，目前尚未取得一致認(rèn)同。本試驗(yàn)通過人工模擬接種，結(jié)合選擇性分離、Bio－PCR和常規(guī)PCR方法，觀察了Aac在無植物殘?bào)w土壤、含病殘?bào)w土壤和田水中的存活情況。結(jié)果表明，Aac在田水中只能存活2個(gè)月，在含病殘?bào)w的土壤中可存活12個(gè)月。盡管病菌存活期時(shí)間的長(zhǎng)短與病殘?bào)w分解的程度有關(guān)，但本試驗(yàn)結(jié)果表明，Aac在不含殘?bào)w的土壤中存活期可達(dá)8個(gè)月。西瓜細(xì)菌性果斑病初侵染源除了種子之外，還有土壤、病殘?bào)w、其他雜草和寄主［19］。采用不同越冬菌源的Aac和接菌方法進(jìn)行致病力試驗(yàn)，結(jié)果表明病果浸出液、干病葉、濕病葉和帶菌土壤越冬后的菌源都有致病力，且以帶菌土壤和干存越冬病葉越冬的菌源致病力較強(qiáng)［20］。選擇無病西瓜種子是西瓜果斑病防治的關(guān)鍵，生產(chǎn)上應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況，特別是對(duì)表面污染了病菌的西瓜種子，可選擇合適的方法對(duì)種子進(jìn)行滅菌處理。如果種子不作任何處理，則務(wù)必要確保西瓜種子中果斑病細(xì)菌已經(jīng)死亡或無危害性。此外，深耕翻土、清除田間帶菌殘株、土壤消毒、土壤閑置或與非寄主作物輪作12個(gè)月以上，結(jié)合防止田間灌溉水污染等措施，均能有效降低西瓜細(xì)菌性果斑病的初侵染來源，控制西瓜果斑病的發(fā)生和流行。因本試驗(yàn)采用人工模擬接種的方法，在不同接種體或場(chǎng)所上接種的病菌濃度和場(chǎng)所的放置環(huán)境與大田情況可能不同，故研究結(jié)果僅為西瓜果斑病的防治提供參考。有關(guān)西瓜細(xì)菌性果斑病的其他初侵染來源，如雜草或其他植物等，還有待進(jìn)一步研究。