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組織工程學(xué)概況組織工程學(xué)是根據(jù)細(xì)胞生物學(xué)、材料科學(xué)和生物工程學(xué)的原理，構(gòu)建生物替代物以維持、修復(fù)損傷組織和器官功能的一門科學(xué)。

組織工程的治療策略通常分為兩類:①利用脫細(xì)胞基質(zhì)(acellularmatrixgraft，ACMG)，為新組織生長提供正確定位、定向，依靠機(jī)體自身的再生能力促進(jìn)組織再生。脫細(xì)胞基質(zhì)通常是應(yīng)用機(jī)械和化學(xué)的方法去除組織中細(xì)胞成分后的富含膠原的基質(zhì)。②利用接種細(xì)胞的脫細(xì)胞基質(zhì)構(gòu)建新的組織器官。

組織工程尿道重建的基礎(chǔ)研究應(yīng)用ACMG修復(fù)尿道缺損的研究已有多年，包括尿道細(xì)胞外基質(zhì)(urethralextracellularmatrix，UECM)、膀胱黏膜下層(bladderacellularmatrixgraft，BAMG)、小腸黏膜下層(smallintestinesubmucosa，SIS)等，它們經(jīng)過脫細(xì)胞處理后，僅保留膠原蛋白、蛋白多糖等低抗原性物質(zhì)。楊嗣星等［3］應(yīng)用UECM進(jìn)行兔的尿道缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)。術(shù)后3周，尿路上皮完全覆蓋細(xì)胞外基質(zhì)，術(shù)后6周，平滑肌細(xì)胞再生，炎性細(xì)胞消失，術(shù)后24周，再生尿道組織與正常尿道組織無區(qū)別。Chen等［4］應(yīng)用豬BAMG修復(fù)兔尿道缺損，術(shù)后尿路造影顯示尿道連續(xù)無狹窄，術(shù)后2個月BAMG表面覆蓋完整的尿路上皮細(xì)胞，術(shù)后3個月炎性細(xì)胞消失，未見瘢痕形成，術(shù)后6個月黏膜下肌纖維束基本成形。Nuininga等［5］采用SIS以鑲嵌補(bǔ)片方式修復(fù)兔的尿道缺損，術(shù)后尿道造影顯示所有試驗(yàn)動物尿道口徑正常無狹窄，術(shù)后1個月尿路上皮細(xì)胞完整覆蓋SIS，炎癥細(xì)胞浸潤，術(shù)后3個月炎癥細(xì)胞消失，平滑肌細(xì)胞再生。盡管采用單純脫細(xì)胞基質(zhì)以補(bǔ)片的方式進(jìn)行尿道修復(fù)已取得較好的效果，但如果尿道損傷較大甚至閉鎖，單純的全管狀材料修復(fù)，療效不佳。修復(fù)段尿道出現(xiàn)萎縮，尿道黏膜下出現(xiàn)雜亂無序的肌束，尿道造影顯示尿道狹窄形成［6］，其原因可能是由于尿道的缺損過長，宿主的滋養(yǎng)血管延伸到缺損中心區(qū)域較為困難，缺乏血供的上皮細(xì)胞爬行能力減弱，難以覆蓋整個創(chuàng)面，并且支架降解較早，宿主的自體細(xì)胞尚未完全覆蓋其上所致，而將種子細(xì)胞接種于管狀膠原基質(zhì)材料修復(fù)長段管狀化尿道缺損則成為一種更好的選擇。DeFilippo等［7］分別用未接種細(xì)胞和接種細(xì)胞的管狀BAMG修復(fù)兔尿道缺損，發(fā)現(xiàn)單純用管狀基質(zhì)修復(fù)的尿道，重建尿道狹窄并纖維化形成，而接種了自體細(xì)胞的管狀膠原基質(zhì)，重建尿道連續(xù)無狹窄發(fā)生。傅強(qiáng)等［8-9］用植入包皮表皮細(xì)胞的BAMG修復(fù)管狀化尿道缺損，術(shù)后3個月修復(fù)段尿道已全部被黏膜覆蓋，黏膜光滑，管腔無明顯狹窄，組織學(xué)顯示術(shù)后修復(fù)段尿道上皮呈表皮細(xì)胞形態(tài)并與宿主尿路上皮存在明顯分界線，經(jīng)長期隨訪觀察發(fā)現(xiàn):術(shù)后6～12個月，修復(fù)段尿道黏膜出現(xiàn)乳頭樣結(jié)構(gòu)，與尿路移行上皮細(xì)胞較為相似，這表明了在長期尿路環(huán)境中，來源包皮的表皮細(xì)胞可以向移行上皮形態(tài)轉(zhuǎn)化。Gu等［10］應(yīng)用硅膠管以腹膜腔作為生物反應(yīng)器構(gòu)建自身管狀尿道修復(fù)材料，組織學(xué)證實(shí)成肌纖維細(xì)胞種植于膠原基質(zhì)，其外有單層間皮細(xì)胞。將此修復(fù)材料對兔的尿道缺損進(jìn)行尿道重建，術(shù)后尿道造影顯示尿道連續(xù)無狹窄，此項(xiàng)研究為我們修復(fù)管狀化尿道缺損提供了新的思路。

組織工程尿道重建的臨床研究Atala等［11］采用BAMG修復(fù)傳統(tǒng)手術(shù)治療失敗的尿道下裂，新建尿道長度為5～15cm，術(shù)后1年尿道造影顯示尿道連續(xù)無狹窄，組織學(xué)證實(shí)重建尿道表現(xiàn)為典型的尿路上皮，術(shù)后隨訪22個月，除1例新建尿道出現(xiàn)陰莖頭下瘺管外，其余患者均治愈。EL-Kassaby等［12］用BAMG對28例尿道狹窄患者進(jìn)行尿道修復(fù)，新尿道長1．5～16cm，術(shù)前和術(shù)后常規(guī)行排尿記錄、體檢、逆行尿路造影、尿流率和膀胱鏡檢查，術(shù)后隨訪36～48個月，僅有4例患者在吻合部位出現(xiàn)輕度狹窄，其余患者治愈，活檢組織學(xué)檢查顯示典型的尿路上皮。Palminteri等［13］應(yīng)用SIS為20例尿道狹窄患者行尿道重建，17例患者尿道狹窄治愈，術(shù)后3個月膀胱鏡檢顯示重建尿道口徑正常無狹窄，但支架部位未被尿路上皮完全替代，原因可能是尿路上皮再生完全至少需要20周才能完成。Fiala等［14］用同樣材料修復(fù)50例尿道狹窄患者，成功率80%，隨訪期間大部分患者均未出現(xiàn)早期或晚期相關(guān)并發(fā)癥，進(jìn)一步證實(shí)SIS在組織工程尿道重建中的應(yīng)用前景。Farahat等［15］近來采用內(nèi)窺鏡技術(shù)對10例復(fù)發(fā)性尿道狹窄患者行SIS補(bǔ)片修復(fù)，術(shù)后8例患者尿道狹窄治愈，僅2例患者表現(xiàn)為輕度的尿道狹窄復(fù)發(fā)，通過定期行尿道擴(kuò)張術(shù)已獲得滿意的治療效果。

目前，口腔黏膜替代已被認(rèn)為是臨床治療尿道狹窄或下裂一類疾病的金標(biāo)準(zhǔn)［13］，但自體取材可導(dǎo)致張口受限、供體部位麻木感等諸多并發(fā)癥［16-17］。因而構(gòu)建組織工程化口腔黏膜是進(jìn)行尿道重建的一項(xiàng)新選擇。Bhargava等［18］將角化細(xì)胞、成纖維細(xì)胞分別從獲取的口腔黏膜表皮層、真皮層分離下來，進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增，達(dá)到足夠數(shù)量后將兩種細(xì)胞種植在去表皮層的真皮上，構(gòu)建組織工程化口腔粘膜。將其植入5例患者體內(nèi)修復(fù)尿道狹窄，3名患者目前尿道狹窄治愈，1例因術(shù)后陰莖體部纖維化合并陰莖痛性勃起需做全段補(bǔ)片切除，另1例因補(bǔ)片的過度增生及纖維化需做部分補(bǔ)片切除，該研究為組織工程化口腔粘膜的臨床應(yīng)用展現(xiàn)了新的前景。Selim等［19］將角化細(xì)胞與成纖維細(xì)胞種植在聚乳酸(polylacticacid，PLA)與聚羥基乙酸(polyg-lycolicacid，PGA)的共聚物PLGA(polylactic-co-glycolicacid)上，構(gòu)建組織工程化口腔黏膜，其機(jī)械強(qiáng)度和彈性約為正?？谇火つさ?0%，為PLGA在尿道組織工程中的應(yīng)用開創(chuàng)了新的前景。2干細(xì)胞的研究概況干細(xì)胞(stemcells，SC)是一類未分化的細(xì)胞，具有自我更新的能力并能進(jìn)行分化以最終形成成熟的非再生細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞［20-21］。根據(jù)分化的不同階段，主要分為:全能干細(xì)胞(受精卵)、多潛能干細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞)、多能干細(xì)胞(成體干細(xì)胞)、單能干細(xì)胞(祖細(xì)胞)［22］。目前研究最多的是胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcells，ESCs)和成體干細(xì)胞(A-dultstemcells)。

干細(xì)胞在尿道重建中的基礎(chǔ)研究理論上ESCs依靠其多分化能力可作為理想的種子細(xì)胞，但獲取胚胎干細(xì)胞往往造成胚胎的破壞，并且將其植入免疫缺陷動物時，有形成畸胎瘤的風(fēng)險［23］。Otta-masathien等［24］研究表明在裸鼠的腎被膜下，胚胎干細(xì)胞在胚胎膀胱間充質(zhì)(embryonicbladdermesen-chyme，EBLM)誘導(dǎo)下產(chǎn)生膀胱上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，并無畸胎瘤的生成。Mauney等［25］應(yīng)用全反式維甲酸在體外成功將胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)成尿路上皮細(xì)胞，為胚胎干細(xì)胞作為組織工程種子細(xì)胞的來源提供了可能性。Frimberger等［26］用種植人胚胎干細(xì)胞的豬小腸黏膜下層修復(fù)大鼠膀胱缺損，術(shù)后28天，膀胱上皮層、粘膜下層和平滑肌層完全再生。成體干細(xì)胞來自骨髓、肌組織、血管內(nèi)皮、皮膚及脂肪等處，可避免獲取胚胎干細(xì)胞時的倫理問題，同時成體干細(xì)胞不會轉(zhuǎn)化為惡性表型，降低了植入體內(nèi)后形成畸胎瘤的風(fēng)險，所以研究者們的目光現(xiàn)已逐漸轉(zhuǎn)移到對成體干細(xì)胞的研究。Shukla等［27］研究顯示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrow-derivedmesen-chymalstemcells)在體外可以成功誘導(dǎo)為平滑肌細(xì)胞，但將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與SIS復(fù)合進(jìn)行豬膀胱擴(kuò)增替代術(shù)時，術(shù)后免疫染色和組織化學(xué)證實(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)并未完全分化為平滑肌細(xì)胞，近來已有研究報道骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用于膀胱擴(kuò)增替代術(shù)時可在體內(nèi)成功分化為平滑肌細(xì)胞［28］。因?yàn)榘螂讟?gòu)建與尿道重建在生物支架及種子細(xì)胞選材上的相似性，因此可借鑒前者指導(dǎo)干細(xì)胞在尿道重建上應(yīng)用。黃紅軍等［29］用種植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的脫細(xì)胞尿道海綿體-尿道基質(zhì)(Acellularspongybodyofurethra-urethralmatrix)修復(fù)兔海綿體尿道缺損，術(shù)后僅1例發(fā)生尿瘺，其余排尿通暢。組織學(xué)檢查:術(shù)后2周見少量毛細(xì)血管及平滑肌細(xì)胞生長，再造尿道腔面完整覆蓋單層尿道上皮，術(shù)后24周，平滑肌細(xì)胞增多，排列規(guī)則，尿道黏膜層由七八層上皮細(xì)胞構(gòu)成，尿道腔面光滑、完整。但是，由于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在骨髓中含量極低，需體外擴(kuò)增較長時間才能達(dá)到構(gòu)建的細(xì)胞數(shù)量;同時由于存在著骨髓抽取過程患者較痛苦等問題，使骨髓來源的干細(xì)胞在應(yīng)用中存在較大的局限性。相對而言，脂肪組織來源豐富，只需要簡單的吸脂手術(shù)即可獲得足夠數(shù)量的脂肪組織，且脂肪組織中脂肪干細(xì)胞(adipose-derivedstemcells，ADSCs)含量豐富，僅需要少量的脂肪組織即可獲得足夠的ADSCs。ADSCs已經(jīng)證明與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有相似的多潛能和自我更新能力［30］，可以誘導(dǎo)分化為具有正常收縮舒張功能的平滑肌細(xì)胞［31-32］。Brzoska等［33］實(shí)驗(yàn)表明脂肪干細(xì)胞經(jīng)體外全反式維甲酸誘導(dǎo)培養(yǎng)可分選出大于80%的上皮細(xì)胞，Liu等［34］研究進(jìn)一步表明，將人ADSCs與尿路上皮細(xì)胞混合培養(yǎng)，可以誘導(dǎo)ADSCs向尿路上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

以上結(jié)果表明脂肪干細(xì)胞可誘導(dǎo)分化出上皮和平滑肌細(xì)胞從而可能作為種子細(xì)胞應(yīng)用于尿道組織工程的修復(fù)重建。張亞等［35］應(yīng)用ADSCs復(fù)合多孔絲素膜(poroussilkfibroinscaf-fold，PSFS)修復(fù)兔的尿道缺損，術(shù)后2周絲素膜結(jié)構(gòu)完整，表面無尿路上皮細(xì)胞形成，膜基底部有血管、膠原組織生長，少量淋巴細(xì)胞浸潤。術(shù)后4周絲素膜表面形成3～4層排列欠規(guī)則的尿路上皮細(xì)胞，黏膜下見大量血管、平滑肌細(xì)胞沿絲素膜孔隙生長。術(shù)后6周絲素膜表面見排列規(guī)則的6～7層尿路上皮細(xì)胞，絲素膜被分解成小塊狀。與單純應(yīng)用多孔絲素膜修復(fù)尿道缺損相比，ADSCs復(fù)合PSFS能加快血管生長、促進(jìn)尿路上皮及平滑肌細(xì)胞生長和加速絲素膜的分解。該研究進(jìn)一步證實(shí)了以干細(xì)胞作為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程化尿道是可行的。Wu等［36］應(yīng)用尿液樣本中獲取的尿源性干細(xì)胞(urine-derivedstemcells，USC)經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)傳代3次，50%～70%尿源性干細(xì)胞分化為平滑肌細(xì)胞，超過90%尿源性干細(xì)胞分化為尿路上皮細(xì)胞。每200ml尿液樣本獲取的尿源性干細(xì)胞在培養(yǎng)傳代4次時即可產(chǎn)生至少3．2×108個活性細(xì)胞，足以用來構(gòu)建工程化的尿道組織。

干細(xì)胞在尿道重建中的臨床展望目前，臨床上進(jìn)行尿道修復(fù)較多應(yīng)用天然或人工的生物支架材料，但如果尿道缺損面積過大乃至閉鎖，單純脫細(xì)胞膠原基質(zhì)的管狀修復(fù)效果不理想［37］，采用體外預(yù)先植入自體上皮細(xì)胞的膠原基質(zhì)進(jìn)行尿道修復(fù)可顯著改善這一難題，但往往存在種子細(xì)胞選擇的問題，干細(xì)胞研究為泌尿系組織工程種子細(xì)胞開辟了新的途徑［38］。盡管干細(xì)胞顯示出巨大的臨床應(yīng)用前景，但在實(shí)際研究中仍存在許多問題:①技術(shù)問題，目前干細(xì)胞在尿道重建中的研究僅限于實(shí)驗(yàn)動物階段，在干細(xì)胞的純化、誘導(dǎo)方面仍缺乏有效的方法［39］;②倫理學(xué)問題，特別是胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用常受到社會的強(qiáng)烈反對［40］;③方法問題，對于植入未分化狀態(tài)的細(xì)胞還是分化狀態(tài)的細(xì)胞仍有較大爭議。因此如何解決好技術(shù)、倫理和方法問題仍將是今后一段時間干細(xì)胞臨床應(yīng)用所面臨的主要問題。3前景隨著再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，組織工程和干細(xì)胞技術(shù)作為再生醫(yī)學(xué)的重要組成部分在許多方面取得了重大進(jìn)展，為尿道的修復(fù)重建提供了新的思路和廣闊的前景。臨床已成功應(yīng)用小塊的工程化組織修復(fù)尿道缺損，但大塊的工程化組織卻不能盡快建立血液循環(huán)，易發(fā)生缺血壞死;干細(xì)胞的應(yīng)用進(jìn)一步拓寬了種子細(xì)胞的來源，但存在倫理問題和致瘤性的風(fēng)險。因此，如何促進(jìn)組織工程化尿道的血管化以及如何純化、誘導(dǎo)干細(xì)胞可能將是今后研究者們在組織工程尿道重建領(lǐng)域進(jìn)一步探索的方向。

作者:王營、傅強(qiáng)單位：上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院