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1尋找差異表達的蛋白質(zhì)

在疾病基因組的研究中,為了尋找差異表達的疾病相關(guān)基因或蛋白質(zhì),除了采用傳統(tǒng)的分子生物學方法,如差減雜交[1]、抑制性差減雜交[2]、差異顯示PCR法[3]及基因表達串聯(lián)分析技術(shù)(serialanalysisofgeneexpression,SAGE)[4]外,還可采用蛋白質(zhì)組學的方法,即從蛋白質(zhì)入手尋找新的或疾病相關(guān)基因或蛋白質(zhì)?；蚝偷鞍踪|(zhì)間并沒有一一對應(yīng)的關(guān)系,有mRNA,不一定能表達為有功能的蛋白質(zhì)。但是,基因要表現(xiàn)其功能,一定要通過相應(yīng)的蛋白質(zhì)。所以,研究基因,特別是疾病相關(guān)基因,可從研究其表達蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能入手。常見的幾種研究差異表達蛋白的蛋白質(zhì)組學方法包括蛋白芯片技術(shù)、雙向電泳技術(shù)、多維液相色譜技術(shù)以及它們和質(zhì)譜鑒定的有機結(jié)合。

1•1蛋白質(zhì)芯片技術(shù)

繼基因芯片以后,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)逐漸發(fā)展起來?；蛐酒纸蠨NA芯片,是以DN段為材料的,而蛋白質(zhì)芯片以蛋白質(zhì)或多肽為材料。利用蛋白芯片技術(shù)能同時從微量的樣品中檢測成千上萬個蛋白質(zhì)或多肽,用于分析差異表達的蛋白質(zhì)及藥物靶標的鑒定,所以,蛋白質(zhì)芯片在藥物基因組學的研究中發(fā)揮著極為重要的作用。眾所周知,蛋白質(zhì)不如核酸穩(wěn)定,在蛋白質(zhì)樣品的處理中將會遇到很多困難,對蛋白質(zhì)芯片的操作將比對基因芯片的操作要求更為嚴格。從基因組測序知道,僅有約30000~35000個基因維持人體正常的生理作用[5],由于RNA編輯及翻譯后修飾等因素,使得人體細胞的總蛋白質(zhì)數(shù)目(蛋白質(zhì)組)遠遠超過有活性的基因數(shù)目。因此,能同時檢測成千上萬蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)芯片技術(shù),是唯一可用來有效研究人體蛋白質(zhì)組的方法。目前,主要將蛋白芯片和表面增強的激光解吸離子化質(zhì)譜技術(shù)(SELDI-MS)相結(jié)合尋找差異表達的蛋白質(zhì)。其原理是將不同生理狀態(tài)的樣品(培養(yǎng)的細胞或組織樣品)和同一蛋白芯片結(jié)合,洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì),然后用SELDI-MS分析結(jié)合的蛋白質(zhì)。一般來說,每種芯片可特異地結(jié)合某一細胞特定的蛋白質(zhì)。具體的操作方法隨不同廠家生產(chǎn)的蛋白芯片不同而異。LiX及其同事[6]將小鼠MRL的耳朵穿刺,觀察耳朵上傷口愈合過程中蛋白質(zhì)表達的變化情況,用蛋白芯片分析的結(jié)果表明,分子量為23•56ku的蛋白在傷口愈合過程中表達量大幅度增加,加速了傷口的愈合。盡管蛋白質(zhì)芯片技術(shù)正逐漸得到廣泛應(yīng)用,但在應(yīng)用于尋找差異表達蛋白時也有局限性:1)待檢的低豐度蛋白往往被高豐度蛋白所掩蓋而不能檢測出來,2)蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)對檢測小分子量的蛋白有效,檢測范圍為10~30ku,但是10~30ku的蛋白只是占總蛋白的一小部分。

1•2多維分離技術(shù)

對于復(fù)雜的蛋白質(zhì)樣品,比如特定組織或細胞中的所有蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)組),僅靠某一分離原理將它們分開是不可能的,而要利用蛋白質(zhì)的不同性質(zhì)將它們分離開,由此而發(fā)展起來的分離技術(shù)叫多維分離技術(shù)(multidimensionalseparation)。目前主要采用的是二維分離技術(shù),因為對于大多數(shù)蛋白質(zhì)的分離,采用蛋白質(zhì)間某兩個性質(zhì)的不同,利用二維分離技術(shù)已足夠了。其中,雙向電泳技術(shù)和二維液相色譜以及它們和質(zhì)譜的聯(lián)用,已成為當今蛋白質(zhì)組學研究的有力工具。

1•2•1雙向電泳技術(shù):雙向電泳(two-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE)技術(shù)是80年展起來的一種有效的二維分離技術(shù)。其原理是基于不同蛋白質(zhì)的等電點和分子量不同的特性,第一相是等電聚焦電泳,第二相是SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。很多實驗室利用不同的雙向電泳技術(shù)建立了特定組織或細胞的雙向電泳數(shù)據(jù)庫(2DPAGE),以供不同的實驗室檢索和比較雙向電泳圖譜。SWISS-2DPAGE是一個經(jīng)注釋過的雙向電泳公共檢索數(shù)據(jù)庫,其格式和SWISS-PROT蛋白序列數(shù)據(jù)庫類似。在SWISS-2DPAGE數(shù)據(jù)庫中包括蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜(其中標明了蛋白質(zhì)的具體位置)、建立圖譜的具體方法和程序、以及相關(guān)的病理和生理數(shù)據(jù)。關(guān)于蛋白質(zhì)的雙向電泳數(shù)據(jù)可通過如下服務(wù)器進行檢索:expasy•hcuge•ch/。在功能基因組時代,雙向電泳技術(shù)除了用于分離復(fù)雜的蛋白樣品,建立雙向電泳數(shù)據(jù)庫外,主要用于尋找不同組織或細胞中差異表達的蛋白質(zhì),以進行疾病相關(guān)蛋白或基因的研究。先用pH3-10的IPG膠條,對疾病組織和正常組織進行雙向電泳分離,然后利用計算機軟件對所產(chǎn)生的2-DE圖譜進行分析,找出差異表達的蛋白。

如果想得到更為詳細的2-DE圖譜,可用pH4-7或pH6-9的膠條,甚至只有一個pH單位的窄pH范圍的膠條,從而使分辨率大大提高。將找到的差異表達蛋白斑點從膠上切下來,經(jīng)酶消化(常用胰蛋白酶),通過質(zhì)譜(MS)或串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)測定和數(shù)據(jù)庫搜索,鑒定出所差異表達蛋白。然而,雙向電泳技術(shù)有許多局限性,由于樣品處理的差別、翻譯后修飾、人為修飾等導(dǎo)致同一基因表達的蛋白質(zhì)遷移到不同的位置;另外,不同的蛋白也會遷移到同一斑點,出現(xiàn)共遷移現(xiàn)象,從而使得用2-DE進行定性和定量分析變得相當復(fù)雜。而且,對于低豐度和低拷貝數(shù)蛋白的檢測也相當困難。雙向電泳要求操作者熟練掌握電泳、染色及軟件分析技術(shù),整個實驗過程中要穿實驗服,戴手套,盡量避免角蛋白等污染,才能得到較好的重復(fù)性。為了改進雙向電泳的重復(fù)性和靈敏度,最近發(fā)展了一種熒光染料標記的雙向電泳技術(shù)即凝膠內(nèi)差別電泳(differentialin-gelelec-trophoresis,DIGE)[7]。將樣品和對照品分別用1-(5-羧戊基)-1′-丙基靛碳氰鹵化物(Cy3)N-羥基琥珀酸酯[1-(5-carboxypentyl)-1′-propylindocarbocyaninehalinge(Cy3)N-hydroxy-succinimidylester]和1-(5-羧戊基)-1′-甲基靛碳氰鹵化物(Cy5)N-羥基琥珀酸酯[1-(5-carboxypentyl)-1′-methylindocarbocyaninehalinge(Cy5)N-hydroxy-succinimidylester]標記。在DIGE時,由于樣品和對照在同一膠內(nèi)分離,使用相同的內(nèi)標,避免了使用不同凝膠時在操作上的偶然性和不平行性,可以準確檢測出兩個不同樣品蛋白表達上的差別,消除膠與膠之間的差異,保證統(tǒng)計上的可靠性及操作上的重復(fù)性。熒光標記較其他染色方法靈敏度更高。與常規(guī)的雙向電泳技術(shù)比較,DIGE更加簡單,勞動強度大大降低,效率大大提高。

1•2•2多維液相色譜-質(zhì)譜技術(shù):液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀用于小分子和大分子的分離和鑒定是一項常規(guī)而重要的技術(shù),將液相色譜和質(zhì)譜用于蛋白質(zhì)組的研究,尤其是差異表達蛋白質(zhì)組的研究,是最近才發(fā)展起來的。目前,利用多維液相色譜-質(zhì)譜進行差異表達蛋白的研究,通常要借助于同位素標記技術(shù),也即是下面所述的ICAT技術(shù)。ICAT技術(shù)是指采用同位素標記多肽或蛋白質(zhì)的親和標簽技術(shù)(isotopecoded-affinitytags,ICAT),可以較準確的鑒定出不同狀態(tài)細胞或組織中差異表達的蛋白質(zhì)。目前的ICAT試劑,大多是用來標記磷酸化蛋白的[8]。對于酵母和細菌細胞,可在培養(yǎng)基中加入同位素進行標記。另外,在蛋白酶解的過程中,可采用18O對蛋白樣品的片段進行標記,而對照品不用同位素標記。當使用胰酶、Glu-C或Lys-C等蛋白酶時,可分別引入2個18O到正在被酶解的肽中?，F(xiàn)在流行的市售ICAT試劑由美國華盛頓大學GygiSP教授[9]等人首先報道。此ICAT試劑的結(jié)構(gòu)包括三個部分:生物素親和標簽,用于分離ICAT標記的多肽;中部的連接子,使引入的同位素更穩(wěn)定;反應(yīng)活性基團,可和半胱氨酸的巰基發(fā)生特異性反應(yīng)。此試劑以兩種形式存在,重試劑(含同位素氘)和輕試劑(不含同位素),前者的質(zhì)量數(shù)比后者多8。利用ICAT試劑標記蛋白,尋找差異表達蛋白質(zhì)的原理是:當樣品和對照分別用重試劑和輕試劑標記后,將兩樣品混合,酶解,過鏈親和素柱,使ICAT標記的肽片段吸附在鏈親和素柱上。將ICAT標記的肽洗脫下來,經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜分析。樣品和其對照表達量的差別可用質(zhì)譜峰的強度(面積)進行定量。將所得的差別峰經(jīng)進一步的串聯(lián)質(zhì)譜分析,數(shù)據(jù)庫搜索,從而鑒定出相應(yīng)的差異表達蛋白質(zhì),并進行進一步的功能鑒定,如Westernblot等。用這種ICAT試劑尋找差異表達蛋白的缺點是只對含半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)有效,而不能測定其它的蛋白質(zhì)和多肽。

2疾病診斷與藥物開發(fā)

蛋白質(zhì)組學方法除了在基礎(chǔ)醫(yī)學研究中用于尋找差異表達蛋白質(zhì),進而找出疾病相關(guān)蛋白質(zhì)外,在疾病基因組學與藥物基因組學的研究中還具有以下幾個方面的作用。

2•1鑒定和疾病相關(guān)的生物標記分子

蛋白質(zhì)組學方法在基礎(chǔ)醫(yī)學研究中的優(yōu)點在于,可以高通量的方式篩選和鑒定和疾病相關(guān)的生物標記分子,用于臨床診斷。HeineG[10]等人利用腦脊液作材料,經(jīng)過雙向電泳分離后的蛋白斑點,用液相色譜-質(zhì)譜分離鑒定,得到了腦脊液的高分辨率肽譜。因腦脊液的肽中包括許多激素、細胞因子和生長因子,在生物體中起著關(guān)鍵作用,它們以多種方式反映機體體內(nèi)平衡中和疾病相關(guān)的變化,如果能從這些肽中鑒定出疾病相關(guān)的標記分子,將可從肽水平上調(diào)查中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病,因而是一種疾病診斷和治療的新方法。KuererHM[11]等人利用高通量的雙向電泳技術(shù),分析乳腺管流體(breastductalfluid)中生化和細胞成分,以監(jiān)測乳腺癌的發(fā)生和進展情況。BrunagelG[12]等人則根據(jù)核基質(zhì)蛋白和結(jié)腸癌的相關(guān)性,利用雙向電泳技術(shù)鑒定病人的肝樣品中是否有核基質(zhì)蛋白,從而判斷結(jié)腸癌病人是否發(fā)生肝轉(zhuǎn)移,以此作為結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的早期診斷。對于蛋白芯片技術(shù),在基礎(chǔ)研究中常用于檢測蛋白質(zhì)修飾、表征蛋白質(zhì)相互作用、信號傳導(dǎo)以及酶動力學研究等。在臨床上,廣泛用于尋找疾病相關(guān)的生物標記分子和疾病診斷。WuW[13]等用SELDI-蛋白芯片技術(shù)鑒定了來自同一病人的兩種頭頸部鱗狀細胞癌細胞株HBSCC10A和VMSCC10B中蛋白的差異表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn),α-烯醇酶、annexin-Ⅰ和annex-in-Ⅱ是頭頸部鱗狀細胞癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的重要分子,以這些分子作為生物標記分子,用于頭頸部鱗狀細胞癌的臨床診斷。對于多維液相或毛細管液相色譜-質(zhì)譜技術(shù),由于可進行連續(xù)和微量檢測,在尋找疾病相關(guān)的生物標記分子方面具有超強的靈敏度。可進行大體積、低豐度蛋白的分析,如對血清樣品[14]和尿液[15]進行蛋白質(zhì)組學的研究。

2•2藥物開發(fā)

因為蛋白質(zhì)直接決定生物體處于健康或疾病狀態(tài),所以,蛋白質(zhì)可作為藥物設(shè)計和開發(fā)的藥靶。利用蛋白質(zhì)組學方法研究健康或疾病生物體蛋白間的相互關(guān)系、疾病病理基礎(chǔ)、鑒定藥物成分、毒性和作用機理,從而改進藥效和藥物安全性。MujerCV[16]等利用雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù),分析了布魯氏桿菌(Brucellamelitensis,BM)的蛋白質(zhì)組。BM是一種細胞內(nèi)兼性革蘭氏陰性桿菌,可引起人或動物的布魯氏熱(brucellosis)。此桿菌的一個屬中至少有6個種。利用雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù),分析了BM致病株16M的蛋白表達模式,并鑒定了所有表達的蛋白質(zhì),對6種布魯氏桿菌減毒疫苗Rev1的蛋白圖譜進行了廣泛研究。從而為發(fā)展疫苗,鑒定致病島(patho-genicityisland),建立宿主專一性、進化相關(guān)性及疾病治療和藥物開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

2•3致病機理研究

用蛋白質(zhì)組學方法研究疾病發(fā)生發(fā)展過程中某些蛋白或多肽水平的變化,從而了解疾病發(fā)生的機理,如對慢性髓性白血病(chronicmyeloidleukemia,CML)分子機理的研究[17]。此病為造血干細胞疾病,標記分子為Bcr-Abl蛋白酪氨酸激酶。讓全能的骨髓干細胞株(FDCP-Mix)有條件的表達Bcr-Abl蛋白酪氨酸激酶,從而使FDCP-Mix細胞株長期暴露于Bcr-Abl中,模擬CML疾病進程。用長期暴露和短期暴露進行對照,用MALDI-Tof質(zhì)譜或LC-MS進行鑒定。分析結(jié)果表明,白三烯(Leukotriene)A4水解酶的表達上調(diào),AnnexinⅥ、液泡ATP合成酶催化亞單位A及mortain的表達下調(diào),表明這些分子在CML的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。將蛋白質(zhì)組學方法用于疾病機理研究的例子很多,這里不再贅述。

3結(jié)束語

隨著蛋白質(zhì)組學技術(shù)發(fā)展的日益成熟,其在疾病基因組和藥物基因組研究中的應(yīng)用將越來越廣泛。人們不僅可以找到疾病相關(guān)的基因,還可搞清楚疾病發(fā)生的機理,鑒定出疾病相關(guān)的生物標記分子,以便用于臨床診斷。在藥物設(shè)計中找到合適的藥靶,開發(fā)出高效快捷的藥物,用于疾病治療。可以預(yù)見,在不久的將來,許多危害人類的頑癥,如糖尿病、艾滋病、高血壓等,將會隨著人類基因組的破譯和蛋白質(zhì)組功能分析的完成而被徹底攻克。