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對(duì)標(biāo)學(xué)習(xí)計(jì)劃范文第1篇

關(guān)鍵詞： 化學(xué)學(xué)習(xí)目標(biāo)設(shè)計(jì) 新手型教師 反思 對(duì)策

優(yōu)質(zhì)的化學(xué)課堂教學(xué)活動(dòng)的完成需要有效的教學(xué)設(shè)計(jì)為基本前提，課時(shí)化學(xué)學(xué)習(xí)目標(biāo)的設(shè)計(jì)是課堂教學(xué)設(shè)計(jì)的第一步。新手型教師，受傳統(tǒng)的教學(xué)環(huán)境和思想的影響，在入職初期對(duì)學(xué)習(xí)目標(biāo)的認(rèn)知和設(shè)計(jì)上存在一些誤區(qū)，這些誤區(qū)在一定程度上影響了課堂教學(xué)，也制約了新手型教師的專業(yè)化發(fā)展。在本文中，筆者將對(duì)自身在學(xué)習(xí)目標(biāo)設(shè)計(jì)上的問題進(jìn)行深入反思并提出對(duì)策。

一、課時(shí)學(xué)習(xí)目標(biāo)設(shè)計(jì)反思

1.學(xué)習(xí)目標(biāo)認(rèn)知誤區(qū)。

（1）學(xué)習(xí)目標(biāo)無用。在入職初期，筆者以傳統(tǒng)教學(xué)理念為指導(dǎo)，認(rèn)為教師是課堂教學(xué)活動(dòng)的主體，課堂是劇場，講臺(tái)是教師表演的舞臺(tái)，而學(xué)生是觀眾。至于教師怎么完成一節(jié)課是教師的主觀行為，是以教科書內(nèi)容為基本載體的直感發(fā)揮，不需要設(shè)計(jì)明確的學(xué)習(xí)目標(biāo)。

（2）學(xué)習(xí)目標(biāo)是形式。在常規(guī)化的教學(xué)過程中，學(xué)校會(huì)進(jìn)行常規(guī)檢查，迫于形勢要求，筆者在教學(xué)設(shè)計(jì)時(shí)照抄優(yōu)秀教案上的教學(xué)目標(biāo)，直接代替學(xué)習(xí)目標(biāo)。照抄來的學(xué)習(xí)目標(biāo)形式上是按照新課程的目標(biāo)要求的三個(gè)維度來設(shè)計(jì)的，但是對(duì)筆者實(shí)際的教學(xué)過程沒有任何的指導(dǎo)意義。

（3）學(xué)習(xí)目標(biāo)是知識(shí)點(diǎn)的羅列。受教師為本的思想束縛，筆者曾一度認(rèn)為所謂的學(xué)習(xí)目標(biāo)就是教師規(guī)定學(xué)習(xí)內(nèi)容，上課前教師通過對(duì)教科書上的內(nèi)容稍作分析，找出教科書上的知識(shí)點(diǎn)，按照教科書上的知識(shí)點(diǎn)呈現(xiàn)順序依次講解，如果學(xué)生掌握了上述的知識(shí)點(diǎn)，就實(shí)現(xiàn)了學(xué)習(xí)目標(biāo)。

（4）學(xué)習(xí)目標(biāo)是課程目標(biāo)。筆者在進(jìn)行教學(xué)設(shè)計(jì)時(shí)，將化學(xué)課程目標(biāo)代替學(xué)習(xí)目標(biāo)。在《分子》的教學(xué)中，將義務(wù)教育化學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)中的內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)直接拿來用。這樣的目標(biāo)是抽象的、不具體的，對(duì)學(xué)生學(xué)習(xí)沒有指導(dǎo)意義。

2.學(xué)習(xí)目標(biāo)設(shè)計(jì)誤區(qū).

（1）過分注重知識(shí)體系。在當(dāng)前的教育體制下，教育評(píng)價(jià)依據(jù)主要是學(xué)生的學(xué)業(yè)成績。筆者在進(jìn)行教學(xué)活動(dòng)時(shí)，考慮更多的是如何能夠提高學(xué)生的成績，尤其面對(duì)中考。在學(xué)習(xí)目標(biāo)的設(shè)計(jì)中，過分關(guān)注教科書中具體知識(shí)內(nèi)容的落實(shí)。

（2）忽視隱性目標(biāo)，強(qiáng)調(diào)顯性目標(biāo)。學(xué)生的發(fā)展不但包括基礎(chǔ)知識(shí)的學(xué)習(xí)、基本技能的鍛煉，而且包括過程的體會(huì)、方法的學(xué)習(xí)、情感的培養(yǎng)、態(tài)度的養(yǎng)成、價(jià)值觀的形成。前者是可以觀察的具體行為變化，后者是不可測量的心理變化。筆者在教學(xué)設(shè)計(jì)時(shí)，往往忽視后者，強(qiáng)調(diào)前者。

3.學(xué)習(xí)目標(biāo)陳述誤區(qū)。

（1）行為主體顛倒。新課程理念提倡學(xué)生的主動(dòng)學(xué)習(xí)。筆者在做學(xué)習(xí)目標(biāo)陳述時(shí)，使用“讓學(xué)生知道溶解的條件”，“培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)探究能力”，“提高學(xué)生的安全意識(shí)”等語句。這樣描述教師的教學(xué)活動(dòng)是錯(cuò)誤的，而應(yīng)該清楚地描述出目標(biāo)達(dá)成的主體是學(xué)生。

（2）行為動(dòng)詞選擇不恰當(dāng)。九年義務(wù)教育化學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)要求，學(xué)習(xí)目標(biāo)陳述應(yīng)該具體。筆者傾向選擇“了解”、“解釋”、“理解”等模糊、籠統(tǒng)的行為動(dòng)詞，這樣的行為動(dòng)詞是無從檢測評(píng)價(jià)的。

（3）行為條件范圍不明確。行為條件主要說明學(xué)生在什么樣的具體情境中獲得學(xué)習(xí)體驗(yàn)。筆者使用這樣的陳述語句“會(huì)查找出常見元素的符號(hào)”，這種描述沒有明確的范圍和條件。應(yīng)該指出“會(huì)利用元素周期表查找常見元素的元素符號(hào)”。

二、課時(shí)學(xué)習(xí)目標(biāo)設(shè)計(jì)的對(duì)策

1.建立對(duì)學(xué)習(xí)目標(biāo)正確認(rèn)知。

學(xué)習(xí)目標(biāo)設(shè)計(jì)是教學(xué)設(shè)計(jì)的方向標(biāo)。學(xué)習(xí)目標(biāo)的設(shè)計(jì)從“知識(shí)與技能”、“過程與方法”、“情感態(tài)度與價(jià)值觀”三個(gè)維度來設(shè)計(jì)，是對(duì)“學(xué)生學(xué)什么”的具體化闡述，是提高學(xué)生化學(xué)科學(xué)素養(yǎng)的根本保證，是學(xué)生學(xué)習(xí)結(jié)果的有效評(píng)價(jià)依據(jù)。

課時(shí)學(xué)習(xí)目標(biāo)的設(shè)計(jì)應(yīng)該按照課程標(biāo)準(zhǔn)的要求，從三維目標(biāo)形式，根據(jù)馬杰提出的ABCD行為目標(biāo)陳述法進(jìn)行陳述。

2.建立對(duì)學(xué)習(xí)目標(biāo)設(shè)計(jì)的正確認(rèn)知觀。

教師在設(shè)計(jì)學(xué)習(xí)目標(biāo)時(shí)要進(jìn)行如下的教學(xué)認(rèn)知活動(dòng)。

（1）研讀課程標(biāo)準(zhǔn)。研讀課程標(biāo)準(zhǔn)主要是研讀課程內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)部分。內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)太抽象、不直觀，不是學(xué)生應(yīng)該掌握的，因此應(yīng)該將內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步細(xì)化，表達(dá)成學(xué)生顯而易見的，通俗易懂的學(xué)習(xí)目標(biāo)。

（2）進(jìn)行教科書分析。首先，進(jìn)行教科書內(nèi)容的具體化分析，先研讀教科書內(nèi)容，在教科書中逐一找到教材內(nèi)容的具體化，即找要點(diǎn)內(nèi)容，具體化的內(nèi)容必須是學(xué)生要記住的，在教科書中通常以例子、實(shí)驗(yàn)，以及“學(xué)完本課題你應(yīng)該知道”的三種形式體現(xiàn)。

其次，進(jìn)行教科書內(nèi)容的進(jìn)一步分析，從內(nèi)容的知識(shí)性質(zhì)和內(nèi)容的回歸性兩個(gè)維度進(jìn)行分析?；瘜W(xué)知識(shí)有四種不同類型，學(xué)習(xí)方式是不同的。在內(nèi)容的知識(shí)性質(zhì)分析時(shí)，最主要確定知識(shí)類型，進(jìn)而確定學(xué)生學(xué)習(xí)方式的產(chǎn)生方式，為行為動(dòng)詞的選擇提供理論依據(jù)。內(nèi)容的回歸性分析就是回歸到在分子和原子水平上研究物質(zhì)，以及物質(zhì)的變化這個(gè)基本主題上。

（3）學(xué)生已有知識(shí)或經(jīng)驗(yàn)分析。學(xué)生已有知識(shí)或經(jīng)驗(yàn)的分析是建立在對(duì)教科書內(nèi)容的第二輪分析的基礎(chǔ)之上的。依據(jù)奧蘇貝爾提出的有意義學(xué)習(xí)原理。教師通過第二輪教科書分析、課后習(xí)題分析，以及練習(xí)冊習(xí)題分析，確定學(xué)生的已有知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)。當(dāng)教師清楚地了解學(xué)生的已有知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)，可以設(shè)計(jì)出有意義的學(xué)習(xí)目標(biāo)。

（4）學(xué)習(xí)目標(biāo)設(shè)計(jì)。

①基本學(xué)習(xí)目標(biāo)的設(shè)計(jì)建立在以教科書內(nèi)容的分析為基礎(chǔ)，以課程標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)為指導(dǎo)依據(jù)，精心設(shè)計(jì)行為動(dòng)詞。

②發(fā)展性學(xué)習(xí)目標(biāo)的設(shè)計(jì)是建立在學(xué)生已有知識(shí)或經(jīng)驗(yàn)分析的基礎(chǔ)上的。

③進(jìn)一步的發(fā)展性目標(biāo)是對(duì)課程標(biāo)準(zhǔn)的挖掘，是基于理解科學(xué)本質(zhì)的目標(biāo)。

參考文獻(xiàn)：

對(duì)標(biāo)學(xué)習(xí)計(jì)劃范文第2篇

關(guān)鍵字：幼兒園;小學(xué)化;對(duì)策中圖分類號(hào)：G612文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B文章編號(hào)：1672-1578（2014）16-0279-011.幼兒園教育"小學(xué)化"傾向的表現(xiàn)

1.1教學(xué)過程小學(xué)化。近幾年來，幼兒園教學(xué)采用了灌輸式教學(xué)方式，幼兒園學(xué)生吃不消該教學(xué)方法。例如：漢語學(xué)習(xí)過程中，教師選擇的授課程序?yàn)椋撼鍪咀挚ɑ蛘邔⑵浒鍟诤诎迳?，教師帶領(lǐng)幼兒進(jìn)行認(rèn)字，給幼兒講解組詞以及字義，進(jìn)行造句訓(xùn)練。同時(shí)，教師還會(huì)給幼兒書寫順序規(guī)范指導(dǎo)，幼兒在教師的指導(dǎo)下進(jìn)行反復(fù)的書寫練習(xí)，這個(gè)教學(xué)過程和小學(xué)生漢子學(xué)習(xí)過程比較相似。幼兒通過自我觀察、自我體會(huì)從而獲得知識(shí)過程比較缺乏，而且幼兒教學(xué)中借助動(dòng)手操作獲得知識(shí)的活動(dòng)也相對(duì)較少。教師比較強(qiáng)化紀(jì)律，比較重視紀(jì)律性，幼兒自逐漸被剝奪。

1.2課程設(shè)置小學(xué)化。有些幼兒園已經(jīng)開設(shè)了小學(xué)一年級(jí)課程，這些課程包含拼音、計(jì)算、漢字以及古詩等等。還有的幼兒園開始增設(shè)了英語、珠心算等教學(xué)課程。在課程設(shè)置上，將少部分的時(shí)間用于游戲、繪畫以及舞蹈。幼兒從小便處于忙碌的學(xué)習(xí)環(huán)境中，這容易導(dǎo)致幼兒天性丟失，容易使得幼兒出現(xiàn)學(xué)習(xí)疲勞。

1.3教育目標(biāo)小學(xué)化。有些幼兒園不將過多的力度放置在幼兒身心健康規(guī)律研究上，而是強(qiáng)調(diào)培養(yǎng)幼兒教育，將其作為教學(xué)目標(biāo)。導(dǎo)教功能難以發(fā)揮，卻過重的強(qiáng)調(diào)教學(xué)目的。幼兒和小學(xué)銜接比較強(qiáng)，很多的幼兒在學(xué)習(xí)中都開始被要求珠算、識(shí)字以及拼音等等，給幼兒布置過多的作業(yè)，會(huì)使得幼兒學(xué)習(xí)出現(xiàn)不良后果。

2.防止幼兒園教育小學(xué)化傾向的對(duì)策

2.1加強(qiáng)課程設(shè)置的生活性。幼兒園教學(xué)課程設(shè)置，應(yīng)該根據(jù)幼兒身心發(fā)展情況確定，需要將幼兒心理需求作為課程布置出發(fā)點(diǎn)。選擇一些可以激發(fā)幼兒學(xué)習(xí)興趣，可以更好引導(dǎo)幼兒發(fā)現(xiàn)問題的內(nèi)容。幼兒教育課程設(shè)置不僅需要充分考慮到知識(shí)內(nèi)部結(jié)構(gòu)組建，還應(yīng)該考慮到知識(shí)之間的邏輯結(jié)構(gòu)和順序。課程設(shè)置時(shí)，應(yīng)該根據(jù)幼兒興趣、幼兒發(fā)展特點(diǎn)以及需求，選擇一些生活化比較強(qiáng)的課程內(nèi)容，使得幼兒在情境中去學(xué)習(xí)，從而體驗(yàn)到學(xué)習(xí)樂趣。幼兒園課程設(shè)置應(yīng)該同現(xiàn)實(shí)生活相互結(jié)合，并且可以逐漸形成五類活動(dòng)，這五類活動(dòng)可以是語文活動(dòng)、藝術(shù)活動(dòng)、科學(xué)活動(dòng)、健康活動(dòng)以及社會(huì)活動(dòng)。一些日常的生活方式都可以納入教學(xué)內(nèi)容，例如：早操、睡眠、游戲以及種植物飼養(yǎng)種植等。因此，在進(jìn)行課程設(shè)置時(shí)，應(yīng)該具備幼兒園設(shè)置特色，應(yīng)該不斷突破傳統(tǒng)的課程內(nèi)容，將局限摒棄。遵循幼兒生活邏輯，滿足幼兒心理世界為基礎(chǔ)上開設(shè)課程，使得個(gè)性化設(shè)置更加符合需求。

2.2注重教學(xué)過程的體驗(yàn)性、活動(dòng)性、游戲性。幼兒教學(xué)應(yīng)該實(shí)現(xiàn)"玩"中"學(xué)"，游戲是幼兒學(xué)習(xí)重要方式。因此，幼兒教學(xué)中應(yīng)該更加注重于幼兒參與性教學(xué)，將體驗(yàn)性、游行性以及活動(dòng)性融合為一體。教師可以綜合使用游戲形式、小組談?wù)撔问揭约安僮餍问竭M(jìn)行多項(xiàng)教學(xué)。逐漸調(diào)動(dòng)幼兒學(xué)習(xí)積極性，在活動(dòng)過程中幼兒強(qiáng)烈的求知欲望被激發(fā)出來。在游戲中獲得樂趣，從而形成積極、樂觀學(xué)習(xí)心態(tài)。幼兒通過親身經(jīng)歷學(xué)習(xí)，通過實(shí)際操作，對(duì)知識(shí)的理解和掌握會(huì)更加深刻。游戲是幼兒學(xué)習(xí)的最有效手段。陳鶴琴先生說過，"游戲是兒童的心理特征，游戲是兒童的工作，游戲是兒童的生命"。幼兒的各種能力是在游戲中獲得的，游戲可以使幼兒的創(chuàng)造能力、思維能力、語言表達(dá)能力、合作能力等得到全面的發(fā)展和提高。因此，教師在進(jìn)行教學(xué)中，應(yīng)該使用各種有趣的游戲活動(dòng)進(jìn)行教學(xué)，從而不斷提高幼兒身心健康。教師可以組織起多種活動(dòng)，例如常見的數(shù)學(xué)發(fā)現(xiàn)活動(dòng)、寫字活動(dòng)以及電腦游戲活動(dòng)等，這些活動(dòng)能夠豐富教學(xué)內(nèi)容，可以激發(fā)幼兒學(xué)習(xí)樂趣。這些活動(dòng)滿足了幼兒對(duì)游戲的需求，還可以在游戲中體驗(yàn)學(xué)習(xí)，該教學(xué)過程更好避免"小學(xué)化"傾向出現(xiàn)。孩子擁有基本的讀、寫、算能力，還可以在游戲中感受游戲樂趣，這是一種自由式學(xué)習(xí)方式，更好避免傾向化教學(xué)出現(xiàn)。

2.3重視幼兒行為規(guī)范訓(xùn)練的自主性、快樂性。幼兒行為規(guī)范一般需要建立在自我管理基礎(chǔ)上，教師應(yīng)該做好學(xué)生啟發(fā)工作，逐漸引導(dǎo)幼兒，使得幼兒有更好的約束力，在學(xué)習(xí)中逐漸養(yǎng)成良好學(xué)習(xí)行為。為了更好的培養(yǎng)幼兒擁有良好學(xué)習(xí)習(xí)慣，應(yīng)該選擇愉快的教育方式，將教學(xué)融入活動(dòng)中。在對(duì)幼兒進(jìn)行規(guī)范性訓(xùn)練過程中，應(yīng)該基于正面去引導(dǎo)，進(jìn)行反復(fù)的強(qiáng)化正確行為，可以給幼兒合適的鼓勵(lì)和表揚(yáng)。教師應(yīng)該明確這個(gè)度的把握，不能傷害的孩子自尊，也不能使得孩子出現(xiàn)高傲心理。教師本身可以起到良好的示范作用，讓孩子參與其中，逐漸引導(dǎo)幼兒進(jìn)行學(xué)習(xí)。在該教學(xué)過程中，將幼兒主體地位展現(xiàn)出來。基于該教學(xué)理念開展教學(xué)，能夠取得良好教學(xué)效果，孩子在該學(xué)習(xí)過程中，獲得自我發(fā)展。

3.結(jié)束語

當(dāng)前幼兒教學(xué)問題備受社會(huì)關(guān)注，在教學(xué)中出現(xiàn)小學(xué)化問題比較嚴(yán)重。因此，需要采取有效教學(xué)方法，避免小學(xué)化問題出現(xiàn)，這才更好的實(shí)現(xiàn)教學(xué)目的，才能讓幼兒基于歡樂的氛圍中，一邊游戲一邊學(xué)習(xí)。參考文獻(xiàn)：

[1]王廷廷."鐐銬下的孩子"--多重視角下的公辦幼兒園教育"小學(xué)化"傾向 [J].西北師范大學(xué)：學(xué)前教育學(xué)

[2]安惠敏，孫麗花.對(duì)幼兒園教育"小學(xué)化"傾向認(rèn)識(shí)的現(xiàn)狀調(diào)查--以幼兒教師為調(diào)查對(duì)象[J].《中國科教創(chuàng)新導(dǎo)刊》 -2013年27期

[3]劉占蘭.我國幼兒園教育質(zhì)量的現(xiàn)狀--與1992年幼兒園質(zhì)量狀況比較[J].《學(xué)前教育研究》 PKU -2012年2期

對(duì)標(biāo)學(xué)習(xí)計(jì)劃范文第3篇

【摘要】 目的 觀察光化學(xué)療法(PUVA)誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞HL-60、K562、NB4凋亡時(shí)對(duì)Fas表達(dá)的影響。方法 人白血病細(xì)胞分別與不同濃度補(bǔ)骨脂素(PSO)、接受或不接受長波紫外線(UVA)照射后共同培養(yǎng)，電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，熒光定量PCR技術(shù)檢測細(xì)胞Fas基因的表達(dá)，流式細(xì)胞儀(FCM)檢測細(xì)胞凋亡率和Fas蛋白的表達(dá)，采用多因素方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果 PUVA處理后的人白血病細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)學(xué)改變；PSO、UVA照射及PUVA可使細(xì)胞凋亡率增加，可上調(diào)白血病細(xì)胞Fas在基因、蛋白水平的表達(dá)，PUVA的作用顯著強(qiáng)于前兩者(P

【關(guān)鍵詞】 光化學(xué)療法；白血??；HL-60細(xì)胞；K562細(xì)胞；NB4細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；Fas

Key words：PUVA therapy；leukemia；HL-60 cells；K562 cells；NB4 cells；apoptosis；Fas

補(bǔ)骨脂素(psoralen，PSO)具有光敏性質(zhì)與抗腫瘤活性。本實(shí)驗(yàn)以不同濃度加波長為360 nm，不同照射時(shí)間的長波紫外線(ultraviolet A，UVA)光照作用于人白血病細(xì)胞HL-60、K562、NB4，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞在光化學(xué)療法(PUVA)后的凋亡情況；電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變；熒光定量PCR及流式細(xì)胞技術(shù)檢測Fas在基因、蛋白水平的表達(dá)情況，以探討PUVA法對(duì)人白血病細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用及部分作用途徑。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人急性髓細(xì)胞白血病(FAB-M2)HL-60細(xì)胞、人紅白血病細(xì)胞K562由大連醫(yī)科大學(xué)惠贈(zèng)；人急性髓細(xì)胞白血病(FAB- M3)NB4細(xì)胞為上海血液學(xué)研究所陳竺院士惠贈(zèng)。

1.2 藥物及主要試劑

PSO由大連理工大學(xué)及本院共同從補(bǔ)骨脂中提取和制備。二甲基亞砜(DMSO)購自北京化工廠，RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清為Gibco產(chǎn)品，小牛血清系杭州四季青生物材料工程公司產(chǎn)品，Trizol為美國GIBCOBRL產(chǎn)品，F(xiàn)as基因表達(dá)試劑盒購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，鼠抗人Fas(CD95)單克隆抗體為美國CALTAG實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)品。

1.3 儀器和設(shè)備

流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司，GLY-10型光量子血液平衡治療儀由徐州華衛(wèi)醫(yī)療設(shè)備公司研制，熒光定量PCR儀(DA7600型)購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

HL-60、K562、NB4細(xì)胞分別常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清及10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(含硫酸慶大霉素0.025 U/mL)中，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。

1.5 分組

依據(jù)紫外線照射時(shí)間將實(shí)驗(yàn)組分為下列2組：長波紫外線照射0 min組；長波紫外線照射5 min組。

1.6 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

收集濃度為5.0×105/mL，經(jīng)PUVA處理的白血病細(xì)胞10 mL，用PBS清洗2次，轉(zhuǎn)入2.0 mL離心管，離心(2 000 r/min)3 min，棄上清，緩緩加入2.5%戊二醛2 mL，4 ℃冰箱靜置2 h以上。磷酸緩沖液沖洗，鋨酸固定，水洗、脫水，浸透、包埋，制定超薄切片，透射電鏡下觀察。

1.7 光化學(xué)療法24 h后白血病細(xì)胞的凋亡情況

取濃度為4.0×105/mL、處于對(duì)數(shù)生長期的白血病細(xì)胞株5 mL，分別加入0、5、10、20、40 μL的PSO，使其在反應(yīng)體系中的終濃度分別為0、10、20、40、80 μg/mL，放入石英比色皿中，在GLY-10型光量子血液平衡治療儀(λ＝360 nm)上以1 J/m2輻射量邊照射邊震蕩，照射時(shí)間分別為0、5 min。處理后各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集5.0×105/mL細(xì)胞，用PBS洗2次，棄上清，加入100 μL碘化丙啶(PI)染液，避光反應(yīng)30 min，加入PBS 400 μL，上機(jī)檢測，并用Multicycle軟件分析得出相應(yīng)的細(xì)胞凋亡百分率。

1.8 光化學(xué)療法24 h后白血病細(xì)胞Fas基因表達(dá)情況

①總RNA提取，采用Trizol一步法提取mRNA，按照試劑盒說明書操作。②cDNA合成，反應(yīng)體系包括：5×反轉(zhuǎn)錄buffer 4 μL(含Mg2+＝4 mmol/L)，反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL)1 μL，dNTPs (10 mmol/L)0.5 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，DEPC水9.7 μL，RNA模板4 μL，總體積20 μL；反應(yīng)條件：37 ℃ 1 h， 95 ℃ 3 min。③將cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系包括：5×定量PCR buffer 10 μL(含Mg2＋＝2 mmol/L)，Taq酶(3 U/μL)1 μL，F(xiàn)as上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，各自的熒光探針1.0 μL(注：上、下游引物，探針的終濃度均為10 pmol/L)，dNTP 1 μL，ddH2O 30 μL，cDNA模板5 μL，總體積50 μL；同時(shí)，將制備的定量模板按照2×108/mL、2×107/mL、2×106/mL、2×105/mL、2×104/mL梯度稀釋，加入不同反應(yīng)管中，在DA7600型熒光PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增；反應(yīng)條件：93 ℃ 2 min，93 ℃ 1 min， 55 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。④反應(yīng)結(jié)束后用由計(jì)算機(jī)計(jì)算定量結(jié)果，再通過換算得出每微克總RNA中Fas的mRNA拷貝數(shù)。上、下游引物及探針序列：Forward Primer：5’-GGGCAT CTGGACCCTCCTA-3’；Reverse Primer：5’-GGCATTAACACTTTTGGA CGATAA-3’；Probe：5’-FAM-CTCTGGTTCTTACGTCTGTTGCTAG- TAMRA-3’。

1.9 光化學(xué)療法24 h后白血病細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)情況

收集白血病細(xì)胞1×106個(gè)，PBS洗滌1次后棄上清液，加入FITC-Fas抗體10 μL，避光孵育20 min，加500 μL PBS上機(jī)檢測Fas蛋白表達(dá)，以FITC-IgG1做對(duì)照。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均來自至少3組平行或3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。各種計(jì)量資料以x±s表示，采用多因素方差分析；所有統(tǒng)計(jì)計(jì)算均用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，P

轉(zhuǎn)貼于 　　2 結(jié)果

2.1 光化學(xué)療法后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變

白血病細(xì)胞HL-60、K562、NB4均出現(xiàn)細(xì)胞體積縮小，胞漿濃縮，胞核體積減小，可裂解成一個(gè)或數(shù)個(gè)致密體，可見核小體碎裂，核染色質(zhì)聚集或邊集，部分染色質(zhì)致密成斑塊狀或沿核膜收縮成新月體狀，整個(gè)細(xì)胞可裂解成大小不一凋亡小體。

2.2 光化學(xué)療法誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的作用

(見表1～表3)表1 PUVA后24 h HL-60細(xì)胞凋亡率(略)注：與0 min組 0 μg/mL比較，*P

2.3 光化學(xué)療法24 h后白血病細(xì)胞Fas基因表達(dá)情況

(見表4～表6)表4 PUVA后24 h HL-60細(xì)胞Fas mRNA的表達(dá)(略)表5 PUVA后24 h K562細(xì)胞Fas mRNA的表達(dá)(略)表6 PUVA后24 h NB4細(xì)胞Fas mRNA的表達(dá)(略)

2.4 光化學(xué)療法24 h后白血病細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)情況

(見表7～表9)表7 PUVA后24 h HL-60細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)(略)表8 PUVA后24 h K562細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)(略)表9 PUVA后24 h NB4細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)(略)

3 討論

PSO的抗腫瘤、抗白血病作用，以及其具有的光敏活性已被人們所認(rèn)識(shí)[1-5]。本院開展了PUVA體外凈化自體骨髓移植治療各類白血病的臨床研究，初步結(jié)果令人鼓舞。

本實(shí)驗(yàn)采用紫外波長為360 nm的GLY-10型光量子血液平衡治療儀和/或補(bǔ)骨脂中提取的PSO對(duì)人白血病細(xì)胞HL-60、K562、NB4進(jìn)行處理，結(jié)果從電鏡下的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變和流式細(xì)胞儀檢測的細(xì)胞凋亡率兩個(gè)方面證實(shí)了PUVA對(duì)白血病細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用。

Fas/FasL系統(tǒng)在傳遞細(xì)胞凋亡信號(hào)中起著重要作用[6]。結(jié)果顯示HL-60、K562、NB4細(xì)胞Fas的表達(dá)下降。當(dāng)Fas水平下調(diào)至低于Fas/FasL途徑誘導(dǎo)凋亡的閾值時(shí)，凋亡受到抑制，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)監(jiān)視，在體內(nèi)無限增殖。熒光定量PCR技術(shù)檢測結(jié)果顯示，PUVA上調(diào)Fas基因的表達(dá)，經(jīng)PUVA作用后，HL-60細(xì)胞Fas基因表達(dá)拷貝數(shù)的數(shù)量級(jí)由對(duì)照組的103上升至106，K562細(xì)胞Fas基因表達(dá)拷貝數(shù)的數(shù)量級(jí)由對(duì)照組的104上升至107，NB4細(xì)胞Fas基因表達(dá)拷貝數(shù)的數(shù)量級(jí)由對(duì)照組的105上升至108，均上調(diào)了3個(gè)數(shù)量級(jí)。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果在Fas蛋白質(zhì)水平上進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)果。由此我們認(rèn)為，PUVA誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用途徑之一是對(duì)Fas/FasL系統(tǒng)的調(diào)控，通過上調(diào)Fas基因而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

另外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PSO、UVA及PUVA均有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及上調(diào)Fas基因、蛋白表達(dá)的作用，但無論從直觀角度還是從統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果上看，PUVA的作用要顯著強(qiáng)于前兩者，再一次證明PSO光敏活性的同時(shí)，也反映出中藥成分PSO的光敏活性在PUVA對(duì)白血病治療作用中的重要性。

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對(duì)標(biāo)學(xué)習(xí)計(jì)劃范文第4篇

doi:10.3969/j.issn.1672-9676.2014.07.055

兒童急性B淋巴細(xì)胞白血?。˙-ALL）在兒童白血病中發(fā)病率較高，B-ALL在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)中占80%～85%［1］，臨床預(yù)后比其他急性白血病較好。但在B-ALL中有一種變異高表達(dá)CD13的急性白血病，我們稱之為B淋巴細(xì)胞白血病變異表達(dá)CD13，這種疾病臨床預(yù)后較差，化療時(shí)副作用大，并發(fā)癥嚴(yán)重，因此，采取合適的護(hù)理對(duì)策，不但可減輕患兒的痛苦，還能達(dá)到滿意的化療效果。近年來我科共收治13例兒童急性B淋巴細(xì)胞白血病變異表達(dá)CD13的患兒，現(xiàn)將護(hù)理體會(huì)報(bào)道如下。

1 臨床資料

選擇2007年5月~2012年5月我院收治的13例患兒，其中男8例，女5例。年齡1~5歲4例，6~12歲9例。均通過骨髓穿刺確診為兒童急性B淋巴細(xì)胞白血病變異表達(dá)CD13。其主要診斷依據(jù)為符合急性B淋巴細(xì)胞白血病免疫表型且具有典型異常高表達(dá)髓系標(biāo)志CD13的特點(diǎn)，在流式細(xì)胞技術(shù)檢驗(yàn)中主要表達(dá)的抗體有CD19,CD34,CD38,HLA-DR,CD20,CD22,TdT及CD13，其形態(tài)學(xué)特點(diǎn)有細(xì)胞胞體大小不等，染色質(zhì)疏松，核仁明顯1~2個(gè)，胞質(zhì)多數(shù)不整齊，邊緣易見突出，部分漿中有可疑細(xì)小顆粒。本組13例患兒中對(duì)初治的4例采用環(huán)磷酰胺+長春新堿+柔紅霉素+潑尼松+左旋門冬酰胺酶（CODPL）方案，雖然并發(fā)癥較少但臨床緩解率較低，預(yù)后較差，化療效果不滿意；后治的9例患兒改用CODPL加小劑量阿糖胞苷治療，臨床緩解率比采用CODPL方案較高，但缺點(diǎn)是化療周期長，化療副作用大，并發(fā)癥嚴(yán)重，其中并發(fā)支氣管肺炎4例，重度感染2例，消化道出血1例，口腔潰瘍1例，化療藥靜脈炎1例。

2 護(hù) 理

2.1 心理疏導(dǎo)及干預(yù) 白血病的治療是一個(gè)很長的過程，目前國內(nèi)治療的療程要求達(dá)到5年。在這漫長的過程中，有效穩(wěn)定患兒及家長的情緒,使其自覺接受治療是保證醫(yī)療效果的關(guān)鍵，還可起到藥物所不能達(dá)到的作用。對(duì)于6歲左右的幼小患兒，因本身的知識(shí)所限，其負(fù)性情緒如焦慮等反應(yīng)就較少，這類患兒要盡量讓家長陪伴,提供有趣的書籍和玩具等,分散其對(duì)穿刺所致的疼痛、化療所致各種反應(yīng)的注意力，還應(yīng)更多地關(guān)注家長的心理變化并進(jìn)行心理指導(dǎo)［2］，因?yàn)榧议L的情緒變化與患兒的心理和治療效果呈直接關(guān)系，要讓家長樹立信心，積極配和治療，并告之化療是治療白血病的重要手段，讓家長了解所用的化療藥物、劑量、副作用及可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)（如合并感染、出血、 血尿、脫發(fā)等），并講解定期化驗(yàn)（血象，骨髓、肝、腎功能，腦脊液等）的必要性，以及患兒所處的治療階段。對(duì)于11歲左右的患兒，雖然對(duì)白血病的危害性還未感到恐懼,但卻很容易受住院治療、化療藥物所致胃腸道反應(yīng)及脫發(fā)后自我形象改變等因素的影響，所以我們要告訴患兒及其家長,脫發(fā)只是暫時(shí)現(xiàn)象,待化療結(jié)束后,頭發(fā)會(huì)慢慢長出來［3］。我們通過以上一系列的心理護(hù)理措施，13例患兒全部積極接受治療，保證了治療方案的有效進(jìn)行。

2.2 感染的觀察與護(hù)理 急性白血病患兒本來自身抵抗力低,再加上使用化療藥物,白細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞數(shù)就會(huì)明顯降低,當(dāng)粒細(xì)胞<0.5×109/L時(shí)，感染的發(fā)生率增高，而粒細(xì)胞<0.1×109/L時(shí)，敗血癥及其他嚴(yán)重感染更易出現(xiàn)。本組患兒中有8例存在不同程度的發(fā)熱,4例支氣管肺炎,2例重度感染,1例口腔潰瘍,以上感染的患兒除應(yīng)用廣譜抗生素外,重度感染的患兒還加用了萬古霉素聯(lián)合治療，萬古霉素雖抗菌力強(qiáng)但毒副作用也大，使用時(shí)注意嚴(yán)格控制滴速在1 h以上，嚴(yán)密觀察有無血尿等腎毒性表現(xiàn)，定期監(jiān)測聽力，發(fā)現(xiàn)耳鳴、眩暈等癥狀及時(shí)處理。護(hù)理時(shí)要嚴(yán)格執(zhí)行消毒隔離制度,保證護(hù)理人員的手衛(wèi)生，病室空氣流通,地面及床頭桌椅均用84消毒液擦拭,做好保護(hù)性隔離。對(duì)于高熱患兒要進(jìn)行體溫監(jiān)測，給予適當(dāng)?shù)慕禍靥幚恚囡嬎?保證水分的攝入。對(duì)于合并支氣管肺炎患兒可霧化吸入生理鹽水+鹽酸氨溴索，進(jìn)行消炎、鎮(zhèn)咳、祛痰等對(duì)癥治療。對(duì)于發(fā)生口腔潰瘍的患兒我們用生理鹽水棉球做口腔護(hù)理，每天2～3次，在潰瘍面涂冰硼散，每天3～4次，漱口液可選用碳酸氫鈉與呋喃西林漱口液交替漱口，如疼痛嚴(yán)重，可用1%普魯卡因2 ml+慶大霉素8萬U+地塞米松2 mg+生理鹽水100 ml溶液含漱，以減輕疼痛［4］。皮膚護(hù)理時(shí)要注意大小便后及時(shí)清潔會(huì)陰處及肛周皮膚以防感染。以上感染病例均得到有效控制，臨床癥狀消失。

2.3 出血的預(yù)防及護(hù)理 要密切觀察患兒口腔、鼻腔、皮膚黏膜、顱內(nèi)及胃腸道有無出血現(xiàn)象。定期監(jiān)測血常規(guī)，一般2~3 d 檢測1次，如血小板低于80×109/L，容易出現(xiàn)出血傾向，此時(shí)要絕對(duì)臥床休息，禁止溫水擦浴、熱敷，注意觀察皮膚及黏膜有無出血點(diǎn)。做各項(xiàng)護(hù)理操作時(shí)應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行無菌技術(shù)，穿刺要準(zhǔn)確無誤，注射治療后要延長穿刺點(diǎn)按壓時(shí)間，一般在5 min以上。發(fā)熱的患兒應(yīng)用藥物退熱時(shí)，要避免使用復(fù)方氨 基 比林、水 楊 酸 類 藥 物，以免加重出血。顱內(nèi)出血是白血病患者常見的死亡原因之一，應(yīng)注意觀察患兒意識(shí)、瞳孔及生命體征的變化，若患兒突然出現(xiàn)視力模糊、頭暈、頭痛、呼吸急促、噴射性嘔吐，甚至昏迷，則提示有顱內(nèi)出血的可能，應(yīng)及時(shí)配合醫(yī)師搶救。本組有1例下消化道出血患兒，經(jīng)給予清淡、高熱量、易消化飲食，嚴(yán)禁辛辣、堅(jiān)硬及過熱的食物，并配合應(yīng)用止血藥物，出血3 d后停止。

2.4 化療藥物應(yīng)用時(shí)的靜脈護(hù)理 有些化療藥物，如長春新堿、阿霉素、柔紅霉素等對(duì)皮膚刺激性較大，多次注射或藥液滲漏都會(huì)引起靜脈周圍組織炎癥或壞死，所以應(yīng)用時(shí)要注意：（1）血管的選擇，要盡量有計(jì)劃從遠(yuǎn)心端向近心端穿刺，并要求護(hù)理人員掌握熟練的靜脈穿刺技巧，避免反復(fù)穿刺血管。若藥物劑量過大，刺激性過強(qiáng)，應(yīng)首先選擇雙上肢粗直的血管注射。每次應(yīng)更換注射部位，若需要長期注射化療藥物，最好使用PICC置管或靜脈港［5］。（2）靜脈注射前應(yīng)先用生理鹽水沖洗，確定針頭在靜脈內(nèi)方可注入藥物；靜脈注射時(shí)要邊抽回血邊注藥；藥物輸注完畢后再用生理鹽水10～20 ml沖洗后方可拔出針頭［6］，拔針后局部按壓數(shù)分鐘，以防藥物外滲或發(fā)生血腫。（3）輸注時(shí)疑有或已經(jīng)發(fā)生化療藥物外滲，立即停止注入，不宜立即拔針，應(yīng)由原部位抽取3～5 ml血液以除去部分藥液，拔除注射針，局部冷敷后再用25%硫酸鎂濕敷，也可用普魯卡因局部封閉。（4）本組中有1例已發(fā)生靜脈炎的患兒，我們采用患肢抬高制動(dòng)，礬冰液濕敷，紫外線燈照射，每日1次，每次30 min，28 d后癥狀基本消失。

3 小 結(jié)

綜上所述，兒童急性B淋巴細(xì)胞白血病變異表達(dá)CD13的患兒在做化療時(shí)，副作用和并發(fā)癥雖然比其他白血病化療時(shí)重，但只要我們通過提前預(yù)防、注意觀察、積極處理等一系列護(hù)理措施，患兒的痛苦就會(huì)降低到最小化，從而達(dá)到滿意的化療效果。

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對(duì)標(biāo)學(xué)習(xí)計(jì)劃范文第5篇

目的 研究高糖對(duì)肝星狀細(xì)胞T6(HSCsT6)增殖及對(duì)轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)、血小板衍化生長因子(PDGF)及Ⅲ型前膠原(PCⅢ)表達(dá)的影響。方法 設(shè)不同葡萄糖濃度組，觀察30min～16h時(shí)間段，各組對(duì)HSCsT6分化、增殖的影響；并用免疫組織化學(xué)方法及放射免疫分析法在48、72h后測胞漿內(nèi)TGFβ1、PDGF及細(xì)胞上清液中PCⅢ的表達(dá)。結(jié)果 在2～16h，1500～6000mg/L濃度葡萄糖對(duì)HSCsT6增殖具有時(shí)間依賴性，而在4500～6000mg/L濃度組更顯著；同時(shí)在4500～6000mg/L濃度組，培養(yǎng)48h后胞漿中TGFβ1和PDGF表達(dá)較對(duì)照組和高滲對(duì)照組明顯增加；培養(yǎng)72h后，細(xì)胞上清液中PCⅢ表達(dá)較對(duì)照組和高滲對(duì)照組明顯增加。結(jié)論 高血糖可能通過刺激HSCsT6分泌TGFβ1、PDGF及PCⅢ促進(jìn)肝纖維化。

【關(guān)鍵詞】 肝星狀細(xì)胞；轉(zhuǎn)化生長因子；血小板衍化生長因子；Ⅲ型前膠原

ABSTRACT: Objective To investigate the effects of high glucose on the proliferation of hepatic stellate cellT6 (HSCT6) and the expressions of transformation growth factorβ1 (TGFβ1)， plateletderived growth factor (PDGF) and precollagen Ⅲ (PCⅢ). Methods Based on glucose groups of different concentration， we observed the proliferation of HSC in 30min-16h time period， and used the methods of immunohistochemistry and radioimmunoassay to measure the expressions of TGFβ1， PDGF and PCⅢ in the supernatant at 48h and 72h. Results In 2-16h time period， the proliferation of HSC was increased stepwise over time in 1500-6000mg/L group， and was more visible in 4500-6000mg/L group. The expressions of TGFβ1 and PDGF increased at 48h， and the expression of PCⅢ in the supernatant increased at 72h in 4500-6000mg/L group compared with that in glucose control and hypertonic control groups. Conclusion High glucose can promote hepatic fibrosis by stimulating the expressions of TGFβ1， PDGF and PCⅢ in HSCT6.

KEY WORDS: hepatic stellate cell (HSC); transformation growth factor (TGF); plateletderived growth factor (PDGF); precollagen Ⅲ (PCⅢ)

肝硬化可由多種病因引起，非酒精性脂肪肝是其常見原因之一，而糖尿病(diabetes mellitus， DM)則被認(rèn)為是非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease， NAFLD)的重要危險(xiǎn)因素。臨床研究表明，高血糖在NAFLD患者肝纖維化形成中起促進(jìn)作用[12]。已證實(shí)高血糖能夠誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells， HSCs)中Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)，并誘導(dǎo)HSCs增殖[3]；其誘導(dǎo)HSCs活化、增殖可能通過依賴轉(zhuǎn)化生長因子(transformation growth factorβ， TGFβ)機(jī)制[4]、TGFβ激活p38有絲分裂原蛋白激酶通路起作用[5]；在糖尿病時(shí)，葡萄糖可通過增加細(xì)胞內(nèi)血小板衍化生長因子(plateletderived growth factor， PDGF)的敏感性引起TGFβ1翻譯水平升高[6]；Ⅲ型前膠原(precollagen Ⅲ， PCⅢ)在肝臟主要由肝星狀細(xì)胞合成，其與肝纖維化形成活動(dòng)程度密切相關(guān)。本試驗(yàn)運(yùn)用不同濃度的葡萄糖刺激體外培養(yǎng)的HSCsT6，運(yùn)用MTT方法檢測HSCsT6的分化、增殖；并探討高糖對(duì)HSCsT6產(chǎn)生TGFβ1、PDGF及PCⅢ的影響，進(jìn)一步研究高糖在肝纖維化形成中的作用及其機(jī)制，以發(fā)現(xiàn)肝纖維化形成的新病因。

1 材料與方法

1.1 材料

肝星狀細(xì)胞(HSCs)采用大鼠HSCsT6細(xì)胞株，由上海第二軍醫(yī)大學(xué)張俊平教授饋贈(zèng)；MTT購自美國Sigma公司；多聚賴氨酸購自美國Sigma公司；兔抗大鼠TGFβ1抗體及兔抗大鼠PDGFBB抗體購自北京中杉生物工程有限公司；PCⅢ放免試劑盒購自北京401研究所。

1.2 試驗(yàn)分組

A組(對(duì)照組)：葡萄糖1000mg/L劑量組；B組：葡萄糖1500mg/L劑量組；C組：葡萄糖3000mg/L劑量組；D組：葡萄糖4500mg/L劑量組；E組：葡萄糖6000mg/L劑量組；F組(高滲對(duì)照組)：甘露醇6000mg/L劑量組。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng)

將凍存于液氮中的 HSC 取出迅速置37℃水浴解凍后移至超凈臺(tái)中，用移液管將細(xì)胞懸液移入離心管加入10倍以上普通DMEM(葡萄糖1000g/L)，1000r/min離心5min，除去上清液，加DMEM 5mL，將細(xì)胞吹打?yàn)榛鞈乙翰⒁浦翢o菌培養(yǎng)瓶中置于5mL/L CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁。

1.3.2 MTT法檢測細(xì)胞的增殖率

HSCs細(xì)胞貼壁長至單層90%～95%時(shí)，2.5g/L胰蛋白酶消化，以普通的DMEM(含100mL/L小牛血清、100IU/mL青霉素、100IU/mL鏈霉素及葡萄糖1000mg/L的培養(yǎng)液)調(diào)整細(xì)胞為1×105個(gè)/mL密度接種于96孔培養(yǎng)板，待HSCs細(xì)胞貼壁長至單層70%～80%時(shí)，換無血清的DMEM同步化細(xì)胞，每孔100μL繼續(xù)培養(yǎng)24h。分別于培養(yǎng)結(jié)束前30min、1、2、4、8、16h加入A液、B液、C液、D液、E液和F液，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，試驗(yàn)重復(fù)3次。培養(yǎng)24h后，每孔加入MTT 20μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)后棄上清，每孔加入150μL DMSO溶解振蕩，待結(jié)晶物充分溶解后(溶液呈藍(lán)紫色)，置酶標(biāo)儀上檢測各孔吸光度值(表1)。

1.3.3 干預(yù)及細(xì)胞上清液的收集

將含普通的DMEM調(diào)整細(xì)胞為1×105個(gè)/mL密度接種于6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)板中DMEM培養(yǎng)液倒出，換用A液、B液、C液、D液、E液和F液培養(yǎng)72h后，收集 HSC 培養(yǎng)上清液于EP管中-20℃凍存待檢。后將收集的PCⅢ各組細(xì)胞上清液送同位素室，采用放射免疫分析法檢測。所有檢測均由專業(yè)技術(shù)人員嚴(yán)格按操作規(guī)程執(zhí)行。

1.3.4 細(xì)胞免疫化學(xué)染色

將HSCs懸液按2×105個(gè)/mL密度傳代于6孔板內(nèi)，使細(xì)胞混懸液覆蓋蓋玻片，換用A液、B液、C液、D液、E液和F液，每小孔中2mL，每組設(shè)3個(gè)小孔，培養(yǎng)48h后，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯形態(tài)變化，細(xì)胞貼壁于蓋玻片生長至90%左右，停止干預(yù)用冷PBS輕柔沖洗細(xì)胞爬片3次，50g/L多聚甲醛固定30min，固定后的細(xì)胞爬片經(jīng)內(nèi)源性過氧化物酶滅活、抗原修復(fù)、羊血清非特異位點(diǎn)封閉后，分別加入兔抗大鼠TGFβ1及PDGF抗體孵育2h，再依次加入二抗試劑液孵育，后進(jìn)行脫水、封片，鏡下觀察。采用HPIAS2000型多媒體彩色圖像分析系統(tǒng)對(duì)染色陽性部位進(jìn)行平均灰度值(average gray scale values， AGSV)的測定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行多組間比較，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用Oneway ANOVA和LSDt檢驗(yàn)，α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 高糖對(duì)HSCs細(xì)胞增殖的影響

MTT法檢測HSCs細(xì)胞增殖率結(jié)果表明：甘露醇組在30min～8h作用時(shí)間對(duì)HSCs增殖無明顯影響；與各濃度組空白對(duì)照相比較：葡萄糖濃度≤3000mg/L時(shí)，在8～16h作用時(shí)間呈時(shí)間依賴性地刺激HSCs增殖，而在30min～4h作用時(shí)間對(duì)HSCs增殖無明顯影響；而當(dāng)葡萄糖濃度≥4500mg/L時(shí)，在2～16h作用時(shí)間呈時(shí)間依賴性地刺激HSCs增殖，而在30min～1h作用時(shí)間對(duì)HSCs增殖無明顯影響(表1)。表1 不同濃度的葡萄糖對(duì)HSCs增殖的影響（略）

2.2 免疫組織化學(xué)方法檢測各濃度組HSCs對(duì)TGFβ1和PDGF的表達(dá)

D組、E組分別與A及F組相比較，TGFβ1、PDGF的表達(dá)均升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2、圖1、圖2)。表2 HSCs產(chǎn)生的TGFβ1和PDGFBB免疫化學(xué)分析平均吸光度值（略）

2.3 放射免疫方法檢測各組細(xì)胞上清液中PCⅢ的表達(dá)

將收集的各組細(xì)胞上清液采用放射免疫分析法檢測PCⅢ的表達(dá)，結(jié)果顯示D組(488.35±61.60)、E組(499.53±79.76)PCⅢ的表達(dá)較A組(288.05±0.68)、F組(311.79±38.20)均增高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均

3 討 論

目前，對(duì)DM的腎臟、神經(jīng)、血管等病變的研究較多，肝臟病變研究較少，其發(fā)病機(jī)制是否相似尚不清楚。HSCs是肝臟細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源，其活化是肝纖維化形成的關(guān)鍵。活化的HSCs可以合成和分泌多種膠原酶和少量的ECM，釋放多種細(xì)胞因子[7]參與肝臟的物質(zhì)代謝。TGFβ是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的肝纖維化促進(jìn)劑[8]，可促進(jìn)ECM的表達(dá)[910]，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的合成，還能刺激肝星狀細(xì)胞產(chǎn)生血小板衍化生長因子(PDGF)。PDGF是肝星狀細(xì)胞的強(qiáng)有絲分裂原[11]，能促使肝星狀細(xì)胞增殖、移行，誘導(dǎo)合成TGFβ1[12]。并且TGFβ1可引起細(xì)胞自分泌，加強(qiáng)細(xì)胞合成膠原，而大量產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)使肝纖維化過程不斷加重，因此，TGFβ1可使肝星狀細(xì)胞的激活處于一種正反饋的不斷加強(qiáng)中[13]。研究表明，高糖可促進(jìn)TGFβ的表達(dá)[14]，并且糖尿病患者體內(nèi)TGFβ的表達(dá)是增加的[15]。PDGF主要由肝內(nèi)枯否細(xì)胞和HSC產(chǎn)生，其中PDGFBB在刺激HSCs生長和相關(guān)細(xì)胞間信號(hào)傳遞方面更為重要[16]。PDGF對(duì)HSC的活化、分裂、增殖有明顯的促進(jìn)作用，且誘導(dǎo)HSCs合成TGF、胰島素樣生長因子(insulin like growth factor， IGF)等細(xì)胞因子?；罨腍SCs分泌活性PDGF，又進(jìn)一步刺激HSC活化，形成了PDGF自分泌循環(huán)。已證實(shí)，高糖環(huán)境能促進(jìn)PDGF及其受體的表達(dá)[17]。高血糖能夠誘導(dǎo)HSCs中Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)以及HSCs增殖；其誘導(dǎo)HSCs活化、增殖及膠原分泌可能通過依賴TGFβ機(jī)制、TGFβ激活p38有絲分裂原蛋白激酶通路起作用；TGFβ1可誘導(dǎo)HSC釋放的CTGF高表達(dá)，后者能促進(jìn)HSC對(duì)Ⅰ、Ⅲ型膠原、LN、金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases， TIMPs)和TGFβ1的高表達(dá)而促進(jìn)了纖維化的形成。

本實(shí)驗(yàn)通過不同濃度的葡萄糖刺激體外培養(yǎng)HSCsT6，結(jié)果顯示：在2～16h，1500～6000mg/L濃度葡萄糖對(duì)HSCsT6分化、增殖具有時(shí)間依賴性，在4500～6000mg/L濃度更顯著。這表明在短期內(nèi)高糖能夠刺激HSCsT6分化、增殖，且增殖程度與葡萄糖作用時(shí)間呈正相關(guān)；HSCsT6在高糖環(huán)境中培養(yǎng)48h后，高濃度組(4500～6000mg/L)胞漿中TGFβ1和PDGF表達(dá)較對(duì)照組和高滲對(duì)照組明顯增加；其在高糖環(huán)境中培養(yǎng)72h后，高濃度組(4500～6000mg/L)細(xì)胞上清液中PCⅢ表達(dá)較對(duì)照組和高滲對(duì)照組明顯增加。表明HSCsT6分泌TGFβ1、PDGF及PCⅢ的量與葡萄糖濃度呈正相關(guān)，并能在短時(shí)間內(nèi)發(fā)揮作用?？紤]高血糖作為糖尿病的重要表現(xiàn)可能通過刺激HSC活化并大量分泌TGFβ1、PDGF及PCⅢ從而促進(jìn)肝纖維化的形成。同時(shí)為排除高滲狀態(tài)對(duì)HSCsT6分泌膠原、細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響，另設(shè)立甘露醇組作為高滲對(duì)照組，通過比較發(fā)現(xiàn)HSCsT6分泌膠原、細(xì)胞因子量的增加與干預(yù)液的滲透壓無關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)雖初步證實(shí)了高糖有致肝纖維化的作用，但仍有待于進(jìn)一步從分子水平，通過研究細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等途徑，來證實(shí)這一理論，使研究進(jìn)入一個(gè)較深的層次。

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