醫(yī)學人類胚胎干細胞建立
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摘要：人類胚胎干細胞(HESCs)在人類發(fā)育生物學研究及再生醫(yī)學中具有重要的應(yīng)用前景。人們在HESCs建系及其分化研究上已取得一些進展，但各個細胞系的生物學特性有一定差異，文章討論了有關(guān)HESCs的標準及相關(guān)問題。
作為人類早期胚胎學研究的窗口及其在再生醫(yī)學中的潛在應(yīng)用，HESCs研究顯得非常重要。一些研究人和動物胚胎系統(tǒng)發(fā)生學的分子生物學家對HESCs功能性分析的分子學和細胞學標準作了一些評述，并指出未來一些重要的研究方法和途徑。本文討論了HESCs的研究進展，旨在就HESCs評價標準進行科學討論。
1HESCs的基本特點
胚胎干細胞(ESCs)有兩個比較顯著的特征：①可以自我更新并保持多能性和未分化狀態(tài)；②具有分化為多種特定細胞類型的能力。HESCs來源于人類早期胚泡(受精后5d)的胚胎內(nèi)細胞團(ICM)。正如鼠胚胎干細胞(MESCs)一樣，HESCs具有以下幾個基本特點：①核型正常；②體外適宜培養(yǎng)條件下可無限擴增和存活；⑧冷凍和解凍后多數(shù)細胞可以復(fù)蘇；④體內(nèi)外可以分化為多種細胞類型。HESCs的這些特點已得到了確認，但一些重要問題還有待解決。
2新的HESCs系的建立
許多國家暫停資助用于HESCs研究的國家基金，使HESCs建系研究受到限制，但由于已有經(jīng)驗及其誘人的應(yīng)用前景，眾多科學家及一些私人研究機構(gòu)都在競相從事HESCs研究。相信會有更多新的HESCs系的建立。
3HESCs培養(yǎng)條件
目前，分離HESCs的方案均源自于MESCs的相關(guān)資料。即用免疫外科法分離得到人類胚泡ICM，無Ca2+-Mg2+培養(yǎng)液離散后培養(yǎng)在經(jīng)處理以抑制其擴增的MEF或人類飼養(yǎng)層細胞上。資料報道適宜培養(yǎng)條件下HESCs可在體外未分化狀態(tài)下存活許多代(高達8O代)。
除了特定生長因子需求外，HESCs培養(yǎng)條件與小鼠相似。MESCs需要細胞因子如白血病抑制因子(LIF)，維持其多能性和未分化狀態(tài)，而HESCs多能性維持則不依賴于LIF，MEF條件培養(yǎng)基是否維持HESCs多能性的信號分子尚未確定。另外，在培養(yǎng)過程中，HESCs同其它人類細胞一樣需要成纖維細胞因子促其生長。培養(yǎng)過程中HESCs的長細胞周期影響其對不同培養(yǎng)條件的反應(yīng)，且在許多方面與MESCs不同。
4HESC自我更新的調(diào)節(jié)
LIF對MESCs未分化狀態(tài)的有效維持是通過膜蛋白gpl30和stat3信號途徑的激活來實現(xiàn)的。雖然，HESCs不需要LIF保持未分化狀態(tài)，但(gpl30、JAK／STAT)下游信號途徑是否參與維持其未分化狀態(tài)尚未研究。HESCs和MESCs所共有信號途徑的程度將決定MESCs實驗方案適用于HESCs的程度。
5所有的HESCs系都相同嗎?
HESCs研究的一個相關(guān)問題是胚胎中存在多少種干細胞狀態(tài)?對這些問題的進一步研究需要比較不同HESCs系之間未分化狀態(tài)下多能性分子標記物以及細胞特點和多潛能性。這些研究在MESCs上已取得了很大進展，但HESCs上尚未開始。目前研究人員用一些MESCs的分子標記對HESCs系進行檢測。這些標記物在ESC中普遍表達豐富，我們建議將這些標記物分為兩類。I類標記物為明確定義的克隆化標記物，Ⅱ類為需要進一步多方面鑒定的標記物。并非所有的小鼠標記物均在人類細胞中表達。例如：SSEA一3和SSEA-4在HESCs表達，而在MESCs不表達；而MESCs表達SSEA一1，但HESCs不表達。確信，隨著對MESCs和HESCs深入研究和分析，會迅速得到許多ESCs標記物，這些特異性表達標記有助于規(guī)范HESC定義。
HESCs的分子標記。表1中所列13種分子標記都是鑒定未分化HESCs的。這些標記在未分化HESCs中表達(豐富)，分化后則消失。它們可分為兩類：I類，明確定義的克隆化標記物，II類，需多方面鑒定的抗體檢測細胞表面抗原。
6HESCs可進行怎樣的遺傳操作?
已有HESCs成功轉(zhuǎn)染操作基因并表達該基因的大量文獻報道。人類反轉(zhuǎn)錄病毒載體(例如痘病毒)以及生化策略表明了基因轉(zhuǎn)染HESCs的可能。如果HESCs用于醫(yī)療，克隆到病毒載體內(nèi)的轉(zhuǎn)染基因的隨機整合應(yīng)引起足夠重視。MESCs的位點特異性重組(剔除或剔入)功能缺失實驗，最近在HESCs上也有了類似報道，使HESC的遺傳操作成為可能。
7為何加強HESCs研究?
包括小鼠在內(nèi)的各種動物構(gòu)成其于細胞生物學的分子特征我們還不是很清楚，但是MESCs和HESCs間的差異已十分顯著。例如培養(yǎng)中的MESCs生長速度明顯快于HESCs；參與MESCs自我更新的配體已確認，MESCs通過遺傳操作的胚胎獲得；而且MESCs更適于作各種體內(nèi)實驗而不受政治和倫理的影響。相反，HESCs很難得到且生長慢；其自我更新的分子機制還不清楚。HESCs也很難進行遺傳操作和體內(nèi)試驗。顯然，討論有關(guān)HESCs和MESCs的基本問題同樣重要。
由于兩者存在差異，如果HESCs可應(yīng)用于臨床，非模型系統(tǒng)HESCs研究將很有必要。
8HESCs是怎樣進行分化的?
體外，HESCs可分化為三個胚層的多種細胞類型(但不是全部)。培養(yǎng)的HESCs可分化為神經(jīng)細胞、皮膚細胞、(表明外胚層分化)，血液，肌肉，軟骨，內(nèi)皮細胞以及心肌細胞(表明中胚層分化)，還可分化成胰島細胞(表明內(nèi)胚層分化)。另外，HESCs還可形成包括三個胚層的類胚體。雖然，HESCs的體外分化潛能與MESCs相當，但是目前還不清楚，這些分化是發(fā)生在正常的胚胎形成過程還是通過其它途徑來實現(xiàn)的?
發(fā)育決定具有時序性，在具體器官和特定細胞類型形成前，胚胎(包括HESCs)要產(chǎn)生三個胚層：外胚層、中胚層、內(nèi)胚層。探尋器官形成的分子途徑，需要確定哪些活動為特定類型細胞形成所必需。例如：通過特定處理促進HESCs分化為特定內(nèi)胚層如胰島細胞。因此，在細胞完成其最終命運前及時分化對于解釋細胞生長中的中間歷程很重要。理解正常的發(fā)育過程有助于我們設(shè)計ESCs促分化程序。雖然在動物模型胚胎中存在許多胚層標記物，但在人類胚胎中目前還沒有全面分析這些標記物。ESCs被定義為在體內(nèi)能產(chǎn)生所有3個胚層和生殖系的一種細胞，將標記過的MESCs移植給不同階段(多為胚泡期)的小鼠胚胎，最終通過標記細胞評價ESC其生成生殖細胞的能力。HESCs體內(nèi)分化潛能需要嚴密的檢測。由于倫理觀念，不可能將HESCs移植到人類胚胎，唯一公開報道的體內(nèi)分化實驗僅是向免疫缺陷小鼠(如NOD／SCID小鼠)皮下注射HESCs，表明其分化特征類似于MESCs。注射后的小鼠形成有3個胚層的畸胎瘤，這有助于評價HESCs的多潛能性，但仍需要其它實驗評價HESCs具有產(chǎn)生胚外細胞及生殖細胞系的潛能。
9HESCs分化能力分析
HESCs體內(nèi)外分析體系的改進對了解與HESCs分化有關(guān)的生物學知識非常必要，也是其在再生醫(yī)學中應(yīng)用的前提。根據(jù)在魚類、青蛙、雞和小鼠胚胎組織發(fā)育研究的結(jié)果已建立了一些離體分析體系。
建立體內(nèi)分析體系比離體分析體系要困難。依據(jù)動物模型建立的經(jīng)驗，設(shè)計了兩種簡單的體內(nèi)試驗，首先，將標記過的HESCs移植入非人類成體或胎兒特定組織的一定部位以檢測其與宿主組織整合的能力。類似實驗將小鼠于細胞體外分化的運動神經(jīng)細胞移植至雞胚，結(jié)果表明這些小鼠干細胞源神經(jīng)細胞參與脊髓形成。已有相關(guān)報道表明，人類胎兒和成體神經(jīng)干細胞以及造血干細胞可移植至小鼠胎兒并能參與多種器官形成。第一個實驗檢測特定胎兒環(huán)境的局部作用，第二個實驗則將標記過的HESCs移植入非人類早期胚胎中檢測HESCs與宿主組織的整合能力。包括小鼠和雞胎胚模型系統(tǒng)的HESCs移植有助于評價HESCs參與宿主組織和器官的形成。此類實驗應(yīng)該是短暫的，即在妊娠的不同時期，胚胎可能被排斥；我們意識到第二個實驗需要適當?shù)目茖W制度的支持。
10HESCs研究的基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)
由于生物材料來源限制，HESCs研究的基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)尤為重要。作者建議建立HESCs貯藏庫并注冊，類似于英國提議的干細胞庫，這個貯藏庫收集所有HESCs系(包括2001年8月9日后所有建系)，用上述標準對其標準化并保證學術(shù)機構(gòu)研究應(yīng)用，質(zhì)量監(jiān)控和規(guī)則可參照一些已建立的中心體系如美國標本培養(yǎng)收藏協(xié)會。貯藏庫要負責HESCs的收集和供給，這將有助于解決研究者的困境。HESCs貯藏庫應(yīng)包括一個大學機構(gòu)和研究人員都可獲得的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，此數(shù)據(jù)庫收集所有有關(guān)HESCs和人類胚胎的數(shù)據(jù)。注冊點向許多地區(qū)提供和獲得相關(guān)資料，包括微陣列分析結(jié)果(原始數(shù)據(jù))或一些細胞傳代法，HESCs系的生長和培養(yǎng)條件，分化潛能以及鑒定方法。
這需要特別重視兩個方面，首先已有資料(如原始微陣列數(shù)據(jù))的質(zhì)量監(jiān)控必須為一個委員會嚴格限定和擁有。作者建議這個委員會由一些具有分子胚胎學、高質(zhì)量數(shù)據(jù)分析以及生物信息學專業(yè)知識的科學家組成。
其次，資料信息的保存和累積需要長期的義務(wù)性努力。本文所述僅是一個起點，期望隨著有關(guān)HESCs和人類胚胎學知識的不斷豐富，HESCs標準會更加具體和豐富。
