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【關(guān)鍵詞】靈芝孢子油；,,免疫,；,,環(huán)磷酰胺

摘要：目的觀察靈芝孢子油的扶正減毒作用。方法以正常和H22荷瘤小鼠為對(duì)象，通過(guò)檢測(cè)外周血WBC數(shù)、骨髓有核細(xì)胞數(shù)、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)來(lái)觀察口服靈芝孢子油(2.5，1.25，0.625g/kg)對(duì)于環(huán)磷酰胺（Cy）化療及60Co放療的減毒作用；通過(guò)小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)、血清溶血素測(cè)定實(shí)驗(yàn)檢測(cè)藥物對(duì)H22荷瘤小鼠免疫功能的影響。結(jié)果靈芝孢子油中高劑量組均可明顯對(duì)抗由大劑量Cy、60Co照射造成的正常及荷瘤小鼠外周血WBC,骨髓有核細(xì)胞數(shù)，脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)下降(P＜0.01,P＜0.05)。靈芝孢子油各劑量均可顯著提高荷瘤小鼠吞噬系數(shù)α，中高劑量組可明顯提高荷瘤小鼠的血清半數(shù)溶血值（P＜0.01,P＜0.05)。結(jié)論靈芝孢子油可減低Cy和60Co所致的骨髓抑制毒性，并可顯著提高小鼠細(xì)胞和體液免疫功能。

關(guān)鍵詞：靈芝孢子油；免疫；環(huán)磷酰胺

靈芝是祖國(guó)醫(yī)藥寶庫(kù)中的珍貴藥品，我國(guó)最早的藥學(xué)專(zhuān)著《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為“上品”。基于靈芝的確切臨床治療作用，近年來(lái)對(duì)其化學(xué)成分及作用機(jī)理進(jìn)行了大量的研究，對(duì)靈芝的生殖細(xì)胞――孢子的藥用價(jià)值研究也日趨深入。以往的研究表明，靈芝孢子具有顯著的防癌、抗腫瘤作用，其功效是靈芝子實(shí)體的60～70倍。本實(shí)驗(yàn)所用靈芝孢子油是利用超臨界CO2流體萃取技術(shù)從靈芝破壁孢子中提取出來(lái)并濃縮富集而得，其各種有效成分（如三萜類(lèi)）的含量均較傳統(tǒng)提取方法顯著提高。本實(shí)驗(yàn)主要研究其對(duì)荷瘤小鼠的免疫調(diào)節(jié)及對(duì)常規(guī)放化療的減毒作用，以期為靈芝孢子油的臨床抗腫瘤輔助應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料

1.1藥物靈芝孢子油，由廣州靈芝孢子油現(xiàn)代中藥研究開(kāi)發(fā)有限公司提供，批號(hào)：050601，臨用前用豆油稀釋成所用濃度。云芝孢內(nèi)糖肽膠囊，南京老山藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：050104，規(guī)格：0.5g×21粒，臨用前用生理鹽水成所用濃度。注射用環(huán)磷酰胺，上海華聯(lián)制藥有限公司，規(guī)格：200mg/瓶，批號(hào)：020804。

1.2瘤株與動(dòng)物H22小鼠肝癌細(xì)胞，由中科院上海藥物研究所提供。ICR小鼠，雌雄各半，18~22g，由中國(guó)藥科大學(xué)動(dòng)物室提供,合格證號(hào)：蘇動(dòng)質(zhì)SCXK（蘇）2002-0011。

2方法

2.1靈芝孢子油對(duì)正常、H22荷瘤小鼠化療(Cy)的減毒作用取ICR小鼠60只，按移植性腫瘤研究法［1］接種H22實(shí)體瘤，24h后隨機(jī)分組，實(shí)驗(yàn)設(shè)：空白對(duì)照組，豆油對(duì)照組(20ml/kg)，靈芝孢子油高、中、低劑量組(2.5，1.25，0.625g/kg)ig給藥，云芝胞內(nèi)糖肽膠囊組(1g/kg)ig給藥。另取ICR小鼠60只，不接種荷瘤，分組給藥方法同上。各組給藥1次/d，共7次，各組于給藥第4，5天（除空白組外），連續(xù)2dipCy(100mg/kg)，于停藥后24h，各組眼眶靜脈取血，鏡檢外周血白細(xì)胞總數(shù)，同時(shí)摘取一側(cè)完整股骨、胸腺、脾臟，分別測(cè)定骨髓有核細(xì)胞數(shù)，稱(chēng)胸腺、脾重，計(jì)算胸腺、脾臟系數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理(t檢驗(yàn))。

2.2靈芝孢子油對(duì)正常小鼠、H22荷瘤小鼠60Co放療的減毒作用取ICR小鼠60只，按移植性腫瘤研究法［1］接種H22實(shí)體瘤，24h后除空白對(duì)照組10只動(dòng)物外，其余50只小鼠進(jìn)行60Co照射，劑量為500rad；60Co照射后動(dòng)物隨機(jī)分為5組，實(shí)驗(yàn)設(shè)：空白對(duì)照組，豆油對(duì)照組(20ml/kg)，靈芝孢子油高、中、低劑量組(2.5，1.25，0.625g/kg)ig給藥，云芝胞內(nèi)糖肽膠囊組(1g/kg)ig給藥。另取ICR小鼠60只，不接種荷瘤，除空白對(duì)照組10只動(dòng)物外，其余50只小鼠進(jìn)行60Co照射，劑量為500rad；60Co照射后動(dòng)物隨機(jī)分為5組，分組及給藥方法同上。各組均給藥1次/d，共7次，于停藥后24h，各組眼眶靜脈取血，鏡檢外周血白細(xì)胞總數(shù)，同時(shí)摘取一側(cè)完整股骨、胸腺、脾臟，分別測(cè)定骨髓有核細(xì)胞數(shù)，稱(chēng)胸腺、脾重，計(jì)算胸腺、脾臟系數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理(t檢驗(yàn))。2.3靈芝孢子油對(duì)H22荷瘤小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能的影響取ICR小鼠50只，按移植性腫瘤研究法［1］接種H22實(shí)體型瘤。次日隨機(jī)分為5組，實(shí)驗(yàn)設(shè)：豆油對(duì)照組(20ml/kg)，靈芝孢子油高、中、低劑量組(2.5，1.25，0.625g/kg)ig給藥，云芝胞內(nèi)糖肽膠囊組(1g/kg)ig給藥。共給藥11次。于末次給藥后24h，尾靜脈注射印度墨水，注入后1min及5min從小鼠眼眶后靜脈叢取血，立刻吹入Na2CO3液中，于680nm處比色，按下式計(jì)算廓清指數(shù)K及吞噬系數(shù)α值。所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理(t檢驗(yàn))

廓清指數(shù)K=(logOD1-logOD5)/(t5-t1)

吞噬系數(shù)α=(體重/肝脾合重)×(K)1/3

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2.4靈芝孢子油對(duì)H22荷瘤小鼠體液免疫功能的影響取ICR小鼠50只。按移植性腫瘤研究法［1］接種H22實(shí)體型瘤。次日隨機(jī)分為5組，實(shí)驗(yàn)設(shè)：豆油對(duì)照組(20ml/kg)ig給藥，靈芝孢子油高、中、低劑量組(2.5,1.25,0.625g/kg)ig給藥，云芝胞內(nèi)糖肽膠囊組(1g/kg)ig給藥。共給藥11d，于第7天，各組小鼠腹腔注入綿羊紅細(xì)胞0.2ml/只(20%)進(jìn)行初次免疫，末次給藥1h后，取血，分離血清，測(cè)定并計(jì)算半數(shù)溶血值HC50，進(jìn)行組間t檢驗(yàn)，比較差異的顯著性。

3結(jié)果

3.1靈芝孢子油對(duì)正常小鼠、H22荷瘤小鼠化療(Cy)的減毒作用結(jié)果如表1~2所示，與空白組相比，Cy可顯著抑制正常小鼠和荷瘤小鼠外周血WBC、骨髓有核細(xì)胞數(shù)、胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)（P＜0.01）。與Cy模型組相比，靈芝孢子油中高劑量組及云芝胞內(nèi)糖肽組均可對(duì)抗H22荷瘤和正常小鼠脾臟系數(shù)、胸腺系數(shù)、WBC數(shù)和骨髓有核細(xì)胞數(shù)的下降(P＜0.05或P＜0.01)。

表1靈芝孢子油對(duì)正常小鼠化療的減毒作用(略)

與空白組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與豆油+Cy組比較,*P＜0.05，**P＜0.01，n=10

表2靈芝孢子油對(duì)H22荷瘤小鼠化療的減毒作用(略)

與空白組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與豆油+Cy組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

3.2靈芝孢子油對(duì)正常小鼠、H22荷瘤小鼠60Co放療的減毒作用結(jié)果如表3、4所示，與空白組相比，60Co可顯著降低正常小鼠和荷瘤小鼠外周血WBC、骨髓有核細(xì)胞數(shù)、胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)（P＜0.01）。與60Co模型組相比，靈芝孢子油中高劑量組及云芝胞內(nèi)糖肽組均可明顯抑制正常及荷瘤小鼠脾臟系數(shù)、胸腺系數(shù)、WBC數(shù)和骨髓有核細(xì)胞數(shù)的下降（P＜0.01，P＜0.05）。

表3靈芝孢子油對(duì)正常小鼠60Co放療的減毒作用(略)

與空白組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與豆油+60Co組比較,*P＜0.05，**P＜0.01，n=10

表4靈芝孢子油對(duì)H22荷瘤小鼠60Co放療的減毒作用(略)

與空白組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與豆油+60Co組比較,*P＜0.05，**P＜0.01，n=10

3.3靈芝孢子油對(duì)H22荷瘤小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞吞噬功能的影響結(jié)果如表5所示。與豆油對(duì)照組相比，靈芝孢子油各劑量組及云芝胞內(nèi)糖肽組均可顯著提高H22荷瘤小鼠的廓清指數(shù)K及吞噬系數(shù)α值(P＜0.01或P＜0.05)。表明靈芝孢子油可顯著提高小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞的吞噬功能。

3.4靈芝孢子油對(duì)H22荷瘤小鼠體液免疫功能的影響結(jié)果如表6所示，與豆油對(duì)照組相比，靈芝孢子油中高劑量組及云芝胞內(nèi)糖肽組可顯著提高H22荷瘤小鼠血清半數(shù)溶血值(HC50)(P＜0.01或P＜0.05)。表明靈芝孢子油可顯著提高H22荷瘤小鼠的體液免疫功能。

表5靈芝孢子油對(duì)H22荷瘤小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞吞噬功能的影響(略)

*P＜0.05，**P＜0.01與豆油對(duì)照組比較.n=10

4討論

當(dāng)前對(duì)惡性腫瘤的治療是采用多種治療手段聯(lián)合應(yīng)用的綜合治療模式,而放療、化療作為綜合治療中的重要手段，對(duì)腫瘤細(xì)胞缺乏特異性選擇,在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)也損傷了正常細(xì)胞,致使機(jī)體免疫功能下降,骨髓造血功能明顯受到抑制,引起外周WBC下降,從而影響治療效果。腫瘤患者的免疫功能不僅與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，而且對(duì)判斷腫瘤患者轉(zhuǎn)歸和預(yù)后都有重要的參考價(jià)值［2，3］。腫瘤的存在會(huì)抑制機(jī)體的細(xì)胞免疫及體液免疫功能，而放化療治療又會(huì)進(jìn)一步加重機(jī)體的免疫抑制［4］。因此在抗腫瘤治療中，提高機(jī)體的免疫力、降低放化療的毒性，成為抗腫瘤治療的一個(gè)主要方面。近年來(lái)，中藥因其良好的免疫調(diào)節(jié)、減毒抗癌作用越來(lái)越引起人們的重視，從中藥中尋找抗腫瘤輔助治療的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)［4，5］。靈芝是一味在中醫(yī)中沿用2000多年的中藥，是祖國(guó)中醫(yī)藥寶庫(kù)中的珍品，素有“仙草”之譽(yù)。古今藥理與臨床研究均證明，靈芝確有防病治病、扶正固本、延年益壽之功效，廣泛用于許多慢性病的治療，如癌癥、肝炎、II型糖尿病、高血壓等［7］。近年來(lái)，對(duì)靈芝屬真菌的化學(xué)成分及臨床作用的研究頗多，對(duì)靈芝的生殖細(xì)胞--孢子的藥用價(jià)值研究也日益加強(qiáng)?，F(xiàn)有的研究證明，靈芝孢子具有顯著的防癌、抗腫瘤作用，其功效是靈芝子實(shí)體的60～70倍。靈芝孢子的功效成分主要有三萜類(lèi)、多糖類(lèi)、有機(jī)鍺等［8］。靈芝孢子油是靈芝孢子的脂溶性物質(zhì)，包括全部三萜類(lèi)、核苷及有機(jī)鍺，與部分水溶性物質(zhì)（多糖類(lèi)），經(jīng)濃縮后的集合，具有極佳的抗腫瘤生物活性。本實(shí)驗(yàn)所用的靈芝孢子油是利用破壁靈芝孢子粉由超臨界CO2流體萃取合超聲強(qiáng)化提取，經(jīng)進(jìn)一步濃縮富集而得，其三萜類(lèi)活性成分的含量高于傳統(tǒng)的提取方法。前期體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)，此種方法提取的靈芝孢子油對(duì)多種腫瘤均有明顯的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)研究表明，靈芝孢子油中高劑量組可顯著提高H22荷瘤小鼠的免疫吞噬系數(shù)α及和血清半數(shù)溶血值，說(shuō)明其對(duì)小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES）吞噬功能及其體液免疫功能均有明顯的提高作用。靈芝孢子油對(duì)Cy和60Co照射造成的正常或H22荷瘤小鼠外周血WBC、骨髓有核細(xì)胞數(shù)的減少、免疫器官萎縮等毒性反應(yīng),雖然不能使其完全恢復(fù)到正常水平,但均有明顯保護(hù)作用。由此證明靈芝孢子油具有抗癌、扶正、減低放化療毒性之功效，提示其在臨床抗腫瘤治療中可起到扶正減毒、改善患者生活質(zhì)量的作用，有良好的應(yīng)用前景和研究?jī)r(jià)值。對(duì)于靈芝孢子油提高免疫及對(duì)Cy和60Co照射減毒作用的內(nèi)在機(jī)理，還有待于進(jìn)一步研究。