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一、結(jié)果與分析

1.細胞融合備用小鼠的效價與敏感性結(jié)果免疫小鼠血清抗體效價均達到1∶104，說明獲得較好的免疫效果，其中3號小鼠效價最高為1∶（5．12×104）。以Mo6＋在3．906～1　000μg／L時與過量EDTA鰲合后形成的鰲合物為抑制劑，5只小鼠的抗血清均產(chǎn)生了抑制。其中3號小鼠抑制效果最好，將其A450值轉(zhuǎn)化為B／B0，以B／B0為y軸，以Lg［Mo6＋－EDTA］為x軸，再對Lg［Mo6＋－EDTA］進行回歸分析，3號小鼠的線性回歸方程為y＝－32．185x＋96．364，r為0．977　1，IC50為27．57μg／L。3號小鼠的抑制曲線見圖1。

2.Mo6＋－EDTA　mAb雜交瘤細胞株的建立雜交瘤細胞株的篩選：細胞融合10d后觀察融合效果，4塊細胞培養(yǎng)板384孔中有雜交瘤克隆形成的有375孔，融合率為97．6％；同時進行間接ELISA和阻斷ELISA檢測，陽性48孔，陽性率為14．7％；3次亞克隆后獲得4株雜交瘤細胞，分別命名為1E3、2D7、2F10、4B3。雜交瘤核型鑒定：NS0染色體數(shù)目為62～68條，小鼠脾細胞染色體數(shù)目為40條，本試驗獲得的4株雜交瘤染色體數(shù)目分別為98．3條、99．32條、98．1條、102條，平均99．4條，高于兩個親本的染色體數(shù)目，說明4株雜交瘤確實是兩親本細胞融合后的雜交體。雜交瘤細胞的穩(wěn)定性測定結(jié)果：4株雜交瘤凍存前細胞培養(yǎng)上清效價與凍存15d、30d、60d復蘇培養(yǎng)后上清效價基本一致，說明4株雜交瘤細胞分泌抗體的穩(wěn)定性良好。

3.Mo6＋－EDTA－mAb的免疫學特性鑒定效價測定　篩選出4株雜交瘤細胞，其中4B3株抗體效價最高，細胞培養(yǎng)上清效價為1∶（3．6×102），腹水效價為1∶（5．12×105）。敏感性測定　敏感性結(jié)果見表1，4株雜交瘤細胞株抑制曲線。4株雜交瘤細胞株均獲得較好的敏感性。4株雜交瘤細胞的Mo6＋－EDTA－mAb對Mo6＋－EDTA均具有較高的敏感性；其中4B3細胞株的敏感性最高。特異性鑒定　4B3雜交瘤細胞的mAb的交叉反應試驗結(jié)果可知，4B3雜交瘤細胞的mAb對Mo6＋－EDTA的IC50為23．4μg／L，對Cr3＋－EDTA的IC50為28．59μg／L，具有較高交叉反應率；與其他金屬離子螯合物交叉反應性較低可忽略不計。

二、討論

1.Mo6＋－EDTA－pAb的免疫學特性鑒定抗體的免疫學特性主要體現(xiàn)于抗原抗體反應的結(jié)合容量、親和性和選擇性3個方面。結(jié)合容量大小以效價來衡量，本試驗采用間接ELISA測定其效價，免疫動物后均獲得較高的效價，效價最高達到1∶（5．12×104）。由于pAb為異源性抗體，其親和性不均一，測得Ka值的準確性不高，所以本試驗親和性得檢測用敏感度來衡量，敏感度是由抗原抗體反應的親和性決定的，用IC50值計算靈敏度，代表標準品對抗原抗體結(jié)合50％是的抑制質(zhì)量濃度，IC50值越小，靈敏度越高。本試驗中2號鼠產(chǎn)生的pAb的IC50值為37．94μg／L，在免疫鼠中最低，親和性最好。本研究采用交叉反應試驗鑒定其特異性，結(jié)果表明免疫鼠產(chǎn)生的Mo6＋－EDTA　pAb均具有較高的特異性。

2.雜交瘤細胞株的篩選方法制備高質(zhì)量的mAb需要建立可靠的雜交瘤細胞篩選體系，一般有3條要求，一是準確測定上清效價，二是能夠避免橋抗體的產(chǎn)生，三是確定mAb的特異性。本試驗同時采用間接ELISA和阻斷ELISA篩選陽性雜交瘤，以Mo6＋－ITCBE－OVA作為包被原采用間接ELISA法測定上清效價，Mo6＋－EDTA作為標準品采用阻斷ELISA法確定陽性雜交瘤，可以簡便地篩選出效價高、無橋抗體、特異性強的Mo6＋螯合物雜交瘤細胞株。本試驗所制備Mo6＋－EDTA－mAb為高親和力抗體。

3.關(guān)于交叉反應性mAb的交叉反應性表示mAb與競爭物結(jié)合的結(jié)構(gòu)特異性，是揭示參與反應混合物與其交叉結(jié)合的重要化學參數(shù)。本試驗所制備的Mo6＋－EDTA　mAb除與Cr3＋－EDTA有較強的交叉反應性外，與其他金屬螯合物和EDTA無交叉反應；Khosraviani　M等建立的水樣中Cd2＋間接競爭ELISA檢測方法，也與Hg2＋具有較強的交叉反應；王建華等所建立的鉬離子多克隆抗體ELISA競爭法，也表現(xiàn)出與汞離子有較強的交叉反應。Jones　R　B等采用距離矩陣法（distancematrix，DM）比較不同金屬－螯合劑復合物分子三維結(jié)構(gòu)的差異，發(fā)現(xiàn)Cd2＋－EDTA與Hg2＋－EDTA的三維結(jié)構(gòu)差異最小，認為這可能是抗體對Hg2＋產(chǎn)生交叉反應的主要原因。Love　R　A等認為，螯合劑與金屬離子通過化學鍵結(jié)合而使螯合劑的構(gòu)型發(fā)生改變，螯合劑結(jié)合不同金屬離子具有不同的構(gòu)型，螯合劑的構(gòu)型是決定抗原抗體識別的重要因素。本試驗中Mo6＋－EDTA與Cr3＋－EDTA親和性高，可能是鉬鉻在同一副族，離子半徑相近，原子結(jié)構(gòu)相似，化學性質(zhì)接近的原因。

作者：范國英 王自良 姜金慶 黃華國 張海棠 丁菡 李藝