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保留學(xué)籍申請(qǐng)書范文第1篇

目的: 建立流式微球載體技術(shù)（FMA）檢測(cè)腎綜合征出血熱（HFRS）患者血清抗HFRS 病毒特異性抗體IgM和IgG及細(xì)胞因子含量的新方法。方法: 選擇28例臨床確診的HFRS患者及20例健康人血清標(biāo)本， FMA定量檢測(cè)抗HFRS 病毒IgM和IgG; 定量檢測(cè)細(xì)胞因子IL6和TNFα。檢測(cè)結(jié)果與ELISA法進(jìn)行比較。結(jié)果: FMA檢測(cè)HFRS患者抗HFRS病毒IgM和IgG的陽(yáng)性率分別為92.85%和71.43%， 健康對(duì)照組的抗體陽(yáng)性率（假陽(yáng)性率）為0; HFRS患者血清IL6和TNFα的含量分別為(532.62±397.19) ng/L和(392.68±177.68) ng/L， 明顯高于健康對(duì)照組（38.77±20.32）ng/L（P

【關(guān)鍵詞】 腎綜合征出血熱; IL6; TNFα; 流式細(xì)胞術(shù); 免疫酶技術(shù)

［Abstract］AIM: To establish a flow microbeads assay (FMA) to examine the level of hemorrhagic fever with renal syndrome virus (HFRS V.) specific IgM， IgG and cytokines in HFRS patients. METHODS: Serum samples from 28 cases of HFRS and 20 healthy controls were studied. Serum levels of antiHFRS V. antibodies were qualified and inflammatory cytokines IL6 and TNFα were quantified by FMA. The results were compared with the results by ELISA. RESULTS: FMA showed that the positivity rates for antiHFRS V. IgM and IgG were 92.85% and 71.43%， respectively. None was detected positive in healthy control group. The serum level of IL6 and TNFα in HFRS group were (532.62±397.19) ng/L and (392.68±177.68)ng/L， respectively， which were significantly higher than that in healthy control group (38.77±20.32 ng/L and 15.91±6.91 ng/L， P

［Keywords］hemorrhagic fever with renal syndrome; IL6; TNFα; Flow cytometry; immunoenzyme technology

腎綜合征出血熱（hemorrhagic fever with renal syndrome， HFRS）是由HFRS病毒引起的自然疫源性急性病毒性傳染病。臨床上， 檢測(cè)特異性IgM、 IgG和細(xì)胞因子的方法仍以ELISA法為主， 該技術(shù)是以包被在酶板上的抗原(或抗體)與標(biāo)本中的抗體（或抗原）反應(yīng)， 形成抗原抗體復(fù)合物， 再用酶標(biāo)二抗和酶底物顯色， 通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)。該方法的靈敏度存在缺陷， 并且是一種非均相法檢測(cè)， 必需將未結(jié)合的抗體和酶標(biāo)二抗分離出去后才能進(jìn)行讀數(shù)， 因而增加了操作時(shí)間、 操作步驟和系統(tǒng)誤差。

流式微球載體技術(shù) (flow microbeads assay， FMA) 是利用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）和高聚分子微球載體技術(shù)檢測(cè)可溶性生物分子的新技術(shù)。原理是在聚苯乙烯微球上進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)， 用熒光物質(zhì)標(biāo)記的二抗為示蹤劑， 通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。該方法靈敏度高， 可作均相法分析， 減少了操作步驟和時(shí)間。我們采用FMA檢測(cè)HFRS患者血清異性IgM、 IgG及細(xì)胞因子含量， 并與ELISA方法進(jìn)行了比較。

1 材料和方法

1.1 材料

陜西省疾病預(yù)防控制中心病毒研究室提供的HFRS患者血清28例， 其中男18例， 女10例， 年齡17～52歲， 平均年齡30.6歲。FACSCalibur流式細(xì)胞儀、熒光校準(zhǔn)微球（Flow check）購(gòu)自美國(guó)BD公司。FMA 試劑盒由比利時(shí)魯汶大學(xué)醫(yī)學(xué)院饋贈(zèng)。HFRS病毒抗體定性檢測(cè)試劑盒主要成分包括: 基因工程重組漢灘病毒抗原包被聚苯乙烯微球， 熒光素（FITC）標(biāo)記羊抗人IgM和IgG， 陰性對(duì)照血清和陽(yáng)性對(duì)照血清。人IL6和TNFα試劑盒主要成分包括: 鼠抗人IL6或TNFα抗體包被聚苯乙烯微球， 熒光素（FITC）標(biāo)記鼠抗人IL6和TNFα抗體， 不同濃度梯度的IL6和TNFα標(biāo)準(zhǔn)品。腎綜合征出血熱病毒 IgM、 IgG檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北方生物技術(shù)研究所， IL6、TNFα生物素親和素酶聯(lián)免疫技術(shù)法檢測(cè)試劑盒購(gòu)自晶美生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 FMA檢測(cè)血清特異性抗體

（1）血樣采集: 空腹抽取HFRS病人和健康人靜脈血2 mL， 分離血清，-20℃保存。（2）檢驗(yàn)方法: ①管1空白對(duì)照: 只加微球載體。管2零標(biāo)準(zhǔn)管: 加微球載體和標(biāo)記抗體。管3 陰性對(duì)照。管4 陽(yáng)性對(duì)照。管5此管開(kāi)始為待測(cè)樣本管。②加微球載體: 各管加樣本稀釋液100 μL。所有管加微球載體10μL/管 ， 輕柔震蕩混勻。③加待測(cè)樣本: 管3加陰性對(duì)照10μL、 管4加陽(yáng)性對(duì)照10μL。待測(cè)樣本管加待側(cè)樣本10μL， 輕柔震蕩混勻， 置2～8℃孵育 20 min。④清洗離心: 加PBS 4 mL/管， 3 000 g離心6 min。棄上清， 存留管底微球沉淀約100 μL。⑤標(biāo)記從管2開(kāi)始， 各管加標(biāo)記抗體10μL， 震蕩混勻， 置2～8℃ 、 避光20 min。⑥分析每管加PBS 0.4 mL， 輕柔震蕩混勻后上流式細(xì)胞儀分析: 上機(jī)檢測(cè)前， 用熒光校準(zhǔn)微球校正流式細(xì)胞儀光路和流路， 使變異系數(shù)值（CV）在2.0之內(nèi)。依次上樣， 計(jì)數(shù)>500， 得到每個(gè)測(cè)定樣本熒光強(qiáng)度。（3）結(jié)果判定: ① 臨界值（cutoff值）計(jì)算: 臨界值=陰性對(duì)照熒光強(qiáng)度值×2.1。②陽(yáng)/陰性結(jié)果判定: 測(cè)定樣本熒光強(qiáng)度值≥臨界值為抗體陽(yáng)性。測(cè)定樣本熒光強(qiáng)度值

1.2.2 FMA檢測(cè)血清IL6和TNFα的含量

設(shè)置空白對(duì)照: 只加微球載體。零標(biāo)準(zhǔn)管: 加微球載體和標(biāo)記抗體和標(biāo)準(zhǔn)品管。標(biāo)準(zhǔn)品管最終濃度分別為800、 400、 200、 100、 50 ng/L， 用Weitongcount制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。操作步驟詳見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明書。

1.2.3 ELISA法檢測(cè)血清特異性抗體及IL6和TNFα的含量

按照試劑盒說(shuō)明操作。血清IgM和IgG檢測(cè)結(jié)果判斷采用目測(cè)法， 根據(jù)顯色深淺判陽(yáng)性或陰性。IL6和TNFα檢測(cè)結(jié)果: 在酶標(biāo)儀上檢測(cè)吸光度值， 用CurveExpert1.3統(tǒng)計(jì)軟件， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 并計(jì)算標(biāo)本中細(xì)胞因子含量， 其IL6和TNFα濃度以ng/L表示。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。IgM、IgG、IL6和TNFα的表達(dá)水平， 符合正態(tài)分布以x±s表示。兩組樣本間均數(shù)的比較， 采用t檢驗(yàn); IgM和IgG陽(yáng)性率比較采用χ2檢驗(yàn); 將IL6和TNFα做相關(guān)分析， 計(jì)算相關(guān)系數(shù)（r）和P值， P

2 結(jié)果

2.1 FMA與ELISA方法檢測(cè)血清特異性抗體

結(jié)果見(jiàn)表1、 2。經(jīng)χ2檢驗(yàn)， 兩種方法的陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.33， P>0.05）， 兩種方法符合率IgM和IgG均為11/14=78.6% ， 兩種方法高度相關(guān)。FMA檢測(cè)血清抗體結(jié)果見(jiàn)圖1， 其中IgM兩組比較P

2.2 FMA與ELISA方法檢測(cè)血清IL6和TNFα的含量

ELISA法結(jié)果見(jiàn)表3， FMA法結(jié)果見(jiàn)表4， 圖2?；颊吆徒】等吮容^P0.05）; IL6 的r值為0.215， P值為0.461（P>0.05）， 兩種方法比較均無(wú)相關(guān)關(guān)系， 提示二者無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表3 ELISA方法檢測(cè)血清 IL6和TNFα的含量（略）表4 流式微球載體法檢測(cè)血清 IL6和TNFα的含量（略）

3 討論

研究表明， 人群感染HFRS病毒后僅少數(shù)人發(fā)病， 大部分人呈隱性感染狀態(tài)， 患者感染后抗體出現(xiàn)早， 發(fā)熱1～2 d即可檢測(cè)出lgM抗體， 第7～10天達(dá)高峰; 第5～7天可檢測(cè)出lgG抗體， 第14～20天達(dá)高峰。

在不同的抗體成份中， 對(duì)機(jī)體起免疫保護(hù)作用的主要是由漢灘病毒G1和G2糖蛋白刺激產(chǎn)生的中和抗體和血凝抑制抗體。細(xì)胞免疫在對(duì)HFRS病毒感染的免疫保護(hù)中同樣起重要作用。一些細(xì)胞因子的水平在HFRS的不同病期也有明顯變化［1］。

ELISA法常被用于IgM、IgG及細(xì)胞因子等檢測(cè)， 但因所需樣品量大、精確度小、費(fèi)時(shí)等， 并且一次只能檢測(cè)一種成分， 這些都限制了方法的檢測(cè)范圍與前景。傳統(tǒng)的FCM因只能檢測(cè)顆粒性物質(zhì)， 因而限制了流式細(xì)胞術(shù)的使用。FMA法有機(jī)地整合了有色微球、激光技術(shù)、流體力學(xué)、高速數(shù)字信號(hào)處理器和計(jì)算機(jī)運(yùn)算法則， 在各種應(yīng)用中的檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)的ELISA基本一致， 但有著ELISA無(wú)法比擬的優(yōu)越性: ①通量大; ②標(biāo)本利用率高; ③特異性強(qiáng); ④敏感度高， 動(dòng)力學(xué)范圍寬; ⑤液相反應(yīng); ⑥節(jié)約人力資源; ⑦重復(fù)性好。此外， 吳煦等采用流式免疫微球芯片技術(shù)分析特異性血小板自身抗體及其他物質(zhì)， 與微孔板改進(jìn)抗原捕獲ELISA（MACE）進(jìn)行比較， 兩種試驗(yàn)結(jié)果高度相關(guān)［2］、穩(wěn)定性和重復(fù)性較好［3］、精確度較ELISA 要好， 能同時(shí)進(jìn)行多個(gè)成分的分析［4］。

我們將FMA應(yīng)用到HFRS患者血清異性IgM、IgG及細(xì)胞因子含量的檢測(cè)， 采用間接免疫熒光FMA定量檢測(cè)人血清中HFRS病毒抗體IgM和IgG; 采用雙抗體夾心免疫熒光FMA定量檢測(cè)人IL6和TNFα， 檢測(cè)結(jié)果與ELISA法進(jìn)行比較， FMA檢測(cè)HFRS患者抗HFRS病毒IgM和IgG的陽(yáng)性率分別為92.85%和71.43%， 健康對(duì)照組的抗體陽(yáng)性率（假陽(yáng)性率）為0; HFRS患者血清IL6和TNFα的含量分別為（532.62±397.19）ng/L和（392.68±177.68）ng/L， 明顯高于健康對(duì)照組（38.77±20.32） ng/L（P

在我們檢測(cè)的患者中， 兩種方法檢測(cè)IgM的檢出時(shí)間均為發(fā)病第2天， 高峰均出現(xiàn)在發(fā)病第4～7天， IgG檢出時(shí)間均為發(fā)病第4天， 高峰均出現(xiàn)在發(fā)病第7～14天， 而這與以往的研究結(jié)果不完全相同。兩種方法不同的是FMA法檢測(cè)IgM、IgG可以定量， 而ELISA法不行。兩種方法檢測(cè)血清IL6和TNFα的含量比較， IL6顯著增高時(shí)間均為發(fā)病第4天， 高峰均出現(xiàn)在發(fā)病第4～7天， TNFα顯著增高時(shí)間均為發(fā)病第2天， 高峰均出現(xiàn)在發(fā)病第2～4天， 且IL6和TNFα的濃度呈正相關(guān)。這與江振友等［5］實(shí)驗(yàn)結(jié)果趨勢(shì)相同。細(xì)胞因子在HFRS發(fā)病機(jī)制中所起的重要作用在國(guó)內(nèi)外研究中多有論述。但采用FMA法于以上指標(biāo)的檢測(cè)尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果HFRS患者血清中IL6和TNFα含量較健康對(duì)照組明顯升高， 推測(cè)HFRS患者發(fā)熱、 出血和腎臟損害等病理表現(xiàn)與細(xì)胞因子大量產(chǎn)生密切相關(guān)。

綜上所述， 利用FMA對(duì)HFRS病人血清異性IgM、IgG及細(xì)胞因子含量的檢測(cè)， 克服了以往ELISA法檢測(cè)技術(shù)的缺陷， 提高了HFRS檢測(cè)的準(zhǔn)確度和重復(fù)性， 該方法可以更好的用于臨床， 推動(dòng)HFRS檢測(cè)的研究與應(yīng)用。并在HFRS發(fā)病機(jī)制的探討、 診斷及預(yù)后評(píng)價(jià)中有一定意義。

參考文獻(xiàn)

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［3］江敏， 陶德定， 肖徽， 等. 細(xì)胞可溶性蛋白質(zhì)的流式微球技術(shù)定量檢測(cè)［J］. 中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志， 2007， 16（5）: 617-618.