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【關(guān)鍵詞】Morris水迷宮；一氧化碳中毒；遲發(fā)性腦病；大鼠

Establishmentofdelayedneuropsychologicsequelaeratmodelafteracutecarbonmonoxidepoisoning

【Abstract】AIM:Toestablishthedelayedneuropsychologicsequelaeratmodelafteracutecarbonmonoxide(CO)poisoningforfurtherelucidatingitspathogenesis.METHODS:MaleSDrats(240-280gBW)werepoisonedwithCOintheanimalexperimentalhyperbaricoxygenchamber.CognitiveabilitywasmeasuredbytheescapelatencyofsearchingtheobjectiveintheMorriswatermaze.Thebrainsoftherats(3,7,10,20dafterpoisoning)weretakenforparaffinpathologicalsectionandHEstainingtoobservethepathologicalchangeincerebralcortexandhippocampalarea.RESULTS:Ratslostconsciousnesswhentheywereexposedto2000ppm(partpermillion)COfor40minandthen3000ppmforupto20min.MazetestshowedthattheescapelatencyoftheCOpoisonedratswassignificantlylongerthantheairexposedrats(F=4.74，P=0.047).ThepathologicalexaminationrevealedapparentneuronaldegenerationandnecrosisinthecerebralcortexandhippocampalareainCOpoisonedrats.CONCLUSION:Besidestheevidenceofpathologicresults,ourmodelsbasicallysimulatethepraxiologicchangeinducedbycentralnervoussystemdamageinthepatientswithdelayedneuropsychologicsequelaeafterCOpoisoning.

【Keywords】Morriswatermaze;carbonmonoxidepoisoning;delayedneuropsychologicsequelae;rats

【摘要】目的:建立大鼠急性一氧化碳（co）中毒致遲發(fā)性腦病模型，以探討其發(fā)病機(jī)制.方法:質(zhì)量240~280g雄性SD大鼠，于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)高壓氧艙內(nèi)行急性CO暴露，以Morris水迷宮中搜索目標(biāo)的逃避潛伏期(escapelatency)來(lái)評(píng)價(jià)大鼠的認(rèn)知記憶能力，并于染毒后3，7，10，20d取腦組織，常規(guī)制備石蠟病理切片，行HE染色觀察急性CO中毒后大鼠腦皮質(zhì)及海馬神經(jīng)元的病理性改變.結(jié)果:大鼠在2000×10-6體積分?jǐn)?shù)CO濃度和3000×10-6體積分?jǐn)?shù)CO濃度下分別暴露40min和20min后全部昏迷，Morris水迷宮測(cè)試發(fā)現(xiàn)CO暴露組大鼠逃避潛伏期顯著落后于空氣對(duì)照組（F=4.74，P=0.047），病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)CO暴露組大鼠的皮質(zhì)及海馬有明顯的神經(jīng)元變性壞死.結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)建立的模型基本模擬了CO中毒后遲發(fā)性腦病患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的行為學(xué)特征改變，且有相應(yīng)的病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果作為其佐證.

【關(guān)鍵詞】Morris水迷宮；一氧化碳中毒；遲發(fā)性腦?。淮笫?/p>

【中圖號(hào)】R595.1

0引言

一氧化碳（carbonmonoxide,CO）中毒后3%~30%的患者經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的“假愈期”會(huì)出現(xiàn)以癡呆、精神癥狀和錐體外系癥狀為主遲發(fā)性腦病(delayedneuropsychologicsequelae,DNS)［1］.目前其發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，缺少可靠的動(dòng)物模型是阻礙其深入研究的重要原因之一［2］，主要問(wèn)題在于中毒濃度的掌握和動(dòng)物行為學(xué)評(píng)價(jià)方法的缺陷上.因此，我們嘗試采用急性靜態(tài)CO吸入的方法制備大鼠的DNS動(dòng)物模型，并采用Morris水迷宮來(lái)評(píng)價(jià)中毒后大鼠認(rèn)知記憶能力的改變，為進(jìn)一步研究DNS的發(fā)病機(jī)制提供客觀有效的手段.

1材料和方法

1.1材料

1.1.1CO氣體于染毒前新鮮制備.

1.1.2染毒裝置DWC4501150型（上海七零一所）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)高壓氧艙，艙體為直徑0.45m，長(zhǎng)1m的圓筒形，有效空間160L，可同時(shí)對(duì)4只大鼠染毒.

1.1.3行為實(shí)驗(yàn)裝置由Morris水迷宮和圖像自動(dòng)監(jiān)視系統(tǒng)(MorrisMazeExperimentalAssistantSystem,MMEAS)組成（第四軍醫(yī)大學(xué)防原教研室提供）.Morris水迷宮為內(nèi)壁黑色的不銹鋼圓柱形儲(chǔ)水池(d=100cm，h=50cm)，內(nèi)置一個(gè)高度可調(diào)位置可移動(dòng)的黑色圓臺(tái)，圓臺(tái)頂部直徑為10cm.在水池上緣等距離設(shè)置東南西北四個(gè)標(biāo)記點(diǎn)，以這四個(gè)入水點(diǎn)在水面和水桶底部的投影點(diǎn)，將水面和水池均分為四個(gè)象限，圓臺(tái)設(shè)置于某一象限中間.實(shí)驗(yàn)時(shí)，使水深淹沒(méi)圓臺(tái)頂部2cm，調(diào)節(jié)水溫至22～24℃之間.整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期之內(nèi)室內(nèi)物品擺設(shè)和實(shí)驗(yàn)人員站立位置相對(duì)固定，并嚴(yán)格控制噪聲干擾.MMEAS系統(tǒng)以圖像采集卡、攝像機(jī)、圖像監(jiān)視器等為主要擴(kuò)展硬件，利用圖像軟件包提供的各層次庫(kù)函數(shù)完成數(shù)據(jù)采集和統(tǒng)計(jì)處理.

1.1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物封閉群健康成年雄性SpragueDawley大鼠（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），約9～10wk齡，體質(zhì)量為240～280g.飼養(yǎng)于12h明暗交替，室溫18~23℃環(huán)境，喂飼標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料，不限食水.

1.2方法

1.2.1染毒方法參照Thom等［3］報(bào)道的染毒方法及預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，將清醒大鼠置于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)高壓氧艙內(nèi)（每次最多4只）密封艙門，由進(jìn)氣口加入制備的純凈CO氣體，使艙內(nèi)CO氣體濃度達(dá)到2000×10-6體積分?jǐn)?shù)，維持40min，后補(bǔ)加氣體達(dá)3000×10-6體積分?jǐn)?shù)，約20min，至大鼠出現(xiàn)昏迷時(shí)止.

1.2.2Morris水迷宮行為測(cè)試16只雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1wk后，隨機(jī)分為CO暴露組和空氣對(duì)照組，每組8只.大鼠于CO暴露后的第二日上午10點(diǎn)開(kāi)始行水迷宮實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)時(shí)從除站臺(tái)外的三個(gè)象限隨機(jī)選擇一個(gè)入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁放入水中，每一次入水位置是假性隨機(jī)的.觀察并記錄大鼠尋找并爬上平臺(tái)所需時(shí)間(逃避潛伏期)，如果大鼠在120s內(nèi)未找到平臺(tái)，則人為引導(dǎo)大鼠到達(dá)平臺(tái)且停留30s，這時(shí)逃避潛伏期為120s.實(shí)驗(yàn)每隔一日進(jìn)行一次，持續(xù)到染毒后21d，每次實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練3次，每個(gè)象限一次，每次間隔20min，3次成績(jī)的平均值記為當(dāng)天成績(jī).

1.2.3病理學(xué)檢查28只雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1wk后，隨機(jī)分為A，B，C，D，E5組，其中A，B，C，D4組為實(shí)驗(yàn)組，每組5只，E組8只為空氣對(duì)照組.實(shí)驗(yàn)組按上述染毒方法予以染毒，對(duì)照組按相同步驟注入空氣.A，B，C，D4組分別于染毒后3，7，10，20d取腦，實(shí)驗(yàn)組取腦同時(shí)取2只E組大鼠作為對(duì)照.大鼠用20g/L戊巴比妥鈉(60mg/kg)腹腔麻醉，開(kāi)胸暴露心臟，插管，由左心室經(jīng)主動(dòng)脈快速灌注生理鹽水200mL,40g/L多聚甲醛0.1mol/LPB液400mL，斷頭取腦，再置于多聚甲醛PB液中浸泡24h，根據(jù)大鼠腦定位圖譜選取冠狀切面（Bregma4.16mm）海馬與齒狀回互包平面，按常規(guī)脫水、媒染、浸蠟步驟，將組織塊包埋制成蠟塊，石蠟切片機(jī)連續(xù)切取厚5μm的切片，行HE染色.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS10.0軟件進(jìn)行重復(fù)測(cè)量資料方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2結(jié)果

2.1大鼠染毒表現(xiàn)2000×10-6體積分?jǐn)?shù)CO氣體濃度下，前15min大鼠表現(xiàn)活躍，有輕度的興奮和躁動(dòng)，隨后的25~40min，大鼠呼吸急促，呼吸幅度明顯增大，口鼻粘膜及耳、爪、尾皮膚成櫻桃紅色，補(bǔ)加氣體濃度至3000×10-6體積分?jǐn)?shù)時(shí)，大鼠出現(xiàn)躁狂，隨后四肢癱軟無(wú)力，至60min時(shí)大鼠全部昏迷，出艙后吸入空氣直至意識(shí)恢復(fù).

2.2Morris水迷宮測(cè)試兩組大鼠爬上平臺(tái)的逃避潛伏期均隨學(xué)習(xí)組次的增加而縮短.經(jīng)重復(fù)測(cè)量資料方差分析，CO暴露組大鼠逃避潛伏期落后于空氣對(duì)照組（F=4.74，P=0.047,表1）.

表1兩組大鼠平均逃避潛伏期（略）

2.3HE染色正常對(duì)照組大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元呈圓形或橢圓形，細(xì)胞形態(tài)正常，核膜完整，核仁清晰可見(jiàn)，細(xì)胞核呈淡藍(lán)色（圖1A，B）.CO中毒組大鼠腦內(nèi)有廣泛的病理改變，皮質(zhì)、海馬、以及齒狀回出現(xiàn)大量的神經(jīng)元變性壞死.皮質(zhì)中以頂葉及顳葉皮質(zhì)損傷最為嚴(yán)重，可見(jiàn)點(diǎn)片狀壞死，壞死神經(jīng)元呈三角形或多角形，細(xì)胞縮小，細(xì)胞核固縮，核仁不明顯，周圍出現(xiàn)空暈，在變性壞死的神經(jīng)元周圍可見(jiàn)膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2A）；海馬錐體細(xì)胞層變薄，兩側(cè)細(xì)胞稀疏，CA1區(qū)和CA4區(qū)壞死明顯（圖2B）.以上病理改變?cè)?組腦切片中均可觀察到，以B組、C組最為明顯.D組大鼠腦切片中還可以見(jiàn)到壞死神經(jīng)元被吸收后所留下的龕影（圖2C），其周亦可見(jiàn)到膠質(zhì)細(xì)胞的蹤跡.

3討論

日常生活中的CO中毒，主要是經(jīng)由呼吸道吸入引起，因此，CO中毒模型多采用吸入染毒法制備，一般可分為動(dòng)式和靜式兩種.動(dòng)式吸入染毒有濃度較穩(wěn)定、可避免缺氧及二氧化碳蓄積等優(yōu)點(diǎn)，但該法所需儀器昂貴，CO消耗量巨大，難以普遍應(yīng)用.我們采用靜式吸入法對(duì)大鼠進(jìn)行染毒來(lái)制備DNS模型，CO的使用量不多，實(shí)驗(yàn)室即可自行配置，且染毒艙體的體積較大可有效避免長(zhǎng)時(shí)間染毒過(guò)程中氧分壓降低，二氧化碳分壓上升所導(dǎo)致缺氧對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響，并可同時(shí)對(duì)多只大鼠染毒.

圖1對(duì)照組大鼠組織結(jié)構(gòu)HE×400（略）

圖2大鼠組織結(jié)構(gòu)改變HE×400（略）

CO中毒后DNS患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要表現(xiàn)出癡呆、記憶力受損、定向力障礙等癥狀［1］.而經(jīng)典的Morris水迷宮所檢測(cè)的是大鼠在多次的訓(xùn)練中，學(xué)會(huì)尋找固定位置的隱蔽平臺(tái)，形成穩(wěn)定的空間位置認(rèn)知的能力.從信息的加工和提取方式來(lái)看，這種空間參考記憶應(yīng)該屬于陳述性記憶.而臨床健忘和癡呆的患者，正是陳述性記憶首先受損而且比較突出.與過(guò)去的跳臺(tái)、避暗等檢測(cè)工具相比，Morris水迷宮主要優(yōu)點(diǎn)在于:能系統(tǒng)全面地考察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物空間認(rèn)知加工的過(guò)程，客觀地反映其認(rèn)知水平；將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶障礙和感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)缺陷等分離開(kāi)來(lái)，而且對(duì)動(dòng)物的傷害性刺激作用較小，減少了對(duì)學(xué)習(xí)記憶過(guò)程檢測(cè)的干擾［4］.所以，我們選取Morris水迷宮作為CO中毒后DNS大鼠模型的行為學(xué)評(píng)價(jià)方法.在Morris水迷宮測(cè)試中發(fā)現(xiàn)，CO暴露組大鼠的逃避潛伏期落后于空氣對(duì)照組（F=4.74，P=0.047），提示CO暴露組大鼠出現(xiàn)了認(rèn)知記憶功能的障礙.

海馬區(qū)與大腦學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)，其損傷會(huì)對(duì)這一功能產(chǎn)生嚴(yán)重影響，而DNS患者臨床表現(xiàn)正是以癡呆、記憶力受損等神經(jīng)功能紊亂癥狀為主，提示海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的遲發(fā)性壞死可能是DNS發(fā)病的病理基礎(chǔ).我們復(fù)制的大鼠模型的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理學(xué)檢查顯示:CO暴露后3d，大鼠腦皮質(zhì)和海馬區(qū)細(xì)胞出現(xiàn)變性和壞死，至7~10d時(shí)最為嚴(yán)重，并至少持續(xù)到20d，與Morris水迷宮行為學(xué)檢測(cè)提示中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)損傷的結(jié)果相符合.臨床上DNS患者的影像學(xué)表現(xiàn)亦與本研究結(jié)果相符，如張鐳［5］報(bào)道在CT檢查中，海馬回病變是CO中毒遲發(fā)腦病和急性CO中毒的特異表現(xiàn)；MRI上亦可顯示皮層和海馬區(qū)出現(xiàn)異常高信號(hào)等［6］.

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立的模型基本模擬了CO中毒后DNS患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的行為學(xué)特征改變，且有病理學(xué)檢測(cè)的結(jié)果為這種改變提供了佐證.

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