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摘要：目的探討腹部手術(shù)操作對老年大鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知能力和海馬CA1區(qū)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)陽性神經(jīng)元的影響以及石杉堿甲干預(yù)的結(jié)果。方法20月齡Wistar大鼠32只，隨機(jī)分為對照組、麻醉組、手術(shù)組和石杉堿甲組，石杉堿甲組手術(shù)前給予石杉堿甲灌胃3w，3w后手術(shù)組與石杉堿甲組行脾切除術(shù)。術(shù)后1、3、7d進(jìn)行水迷宮測試，術(shù)后7d取腦使用免疫組織化學(xué)法觀測海馬CA1區(qū)ChAT的表達(dá)。結(jié)果術(shù)后1d進(jìn)行水迷宮測試，與對照組比較，麻醉組、手術(shù)組潛伏期和游泳距離均延長(P<0.05);術(shù)后3d，與對照組比較，手術(shù)組、石杉堿甲組潛伏期和游泳距離進(jìn)一步延長，而石杉堿甲組與手術(shù)組比較,潛伏期和游泳距離均縮短(P<0.05);術(shù)后7d，手術(shù)組與對照組比較,潛伏期和游泳距離延長程度縮小。術(shù)后7d，與對照組、石杉堿甲組比較，手術(shù)組的平臺象限停滯時間百分比以及在平臺象限游泳距離占總游泳距離百分比均減小(P<0.05)。術(shù)后7d，手術(shù)組海馬CA1區(qū)ChAT陽性細(xì)胞數(shù)較對照組和石杉堿甲組增多(P<0.05)。結(jié)論老年大鼠脾切除術(shù)后早期可出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙(POCD)，海馬CA1區(qū)ChAT表達(dá)上調(diào)，預(yù)先給予石杉堿甲0.15mg/kg(連續(xù)3w)可以改善POCD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶的功能。

關(guān)鍵詞：老年大鼠;術(shù)后認(rèn)知功能障礙;膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶;海馬;石杉堿甲

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(POCD)現(xiàn)在臨床上廣泛關(guān)注，老年人由于機(jī)體退行性變導(dǎo)致術(shù)后早期POCD的發(fā)生率大大增加，但其發(fā)生機(jī)制不甚清楚。腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)在高級動物的學(xué)習(xí)記憶中起著重要作用〔1〕，但在POCD發(fā)生機(jī)制中的作用并不清楚。我們選擇反應(yīng)膽堿能神經(jīng)的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)作為觀察指標(biāo)，旨在研究其與POCD發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，探討POCD的發(fā)生機(jī)制。另一方面，目前對POCD預(yù)防和治療的有效性研究較少，為探討對POCD的治療策略，我們對脾切除術(shù)后大鼠POCD進(jìn)行藥物干預(yù)研究。以往研究表明石杉堿甲(HuperzineA,HupA)具有很好的抗衰老和改善學(xué)習(xí)記憶功能作用〔2〕，本文從神經(jīng)生理學(xué)和組織細(xì)胞學(xué)兩方面研究該藥對大鼠脾切除POCD的影響。

1材料與方法

1.1藥物與試劑石杉堿甲(河南竹林眾生制藥公司)，氯胺酮(福建古田藥業(yè)公司),山羊抗ChAT多克隆抗體(Cemicon)。

1.2動物分組及模型制備20月齡雄性Wistar大鼠(甘肅中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)經(jīng)篩選剔除體重過大或過輕及在水中不游動的，共選出動物32只，體重500～550g。按體重分級，隨機(jī)分成4組：對照組,麻醉組,手術(shù)組，石杉堿甲組(n=8)。其中石杉堿甲組給石杉堿甲灌胃，0.15mg·kg-1·d-1，溶于生理鹽水中，連續(xù)灌3w，對照組、麻醉組、手術(shù)組均按體重給與同容量的生理鹽水灌胃3w，3w后手術(shù)組和石杉堿甲組在氯胺酮腹腔注射(25mg/kg)麻醉下行脾切除手術(shù);麻醉組僅給與氯胺酮麻醉，不行手術(shù);對照組僅腹腔注射同容量的生理鹽水。

1.3學(xué)習(xí)、記憶功能的行為學(xué)測試通過Morris水迷宮測試,將圓池內(nèi)壁和平臺漆成黑色，將其分為4個象限，平臺置于第4象限沒入水下約2cm，選擇一個象限的固定位置作為大鼠入水點，通過自動圖像拍攝系統(tǒng)記錄游泳軌跡，入水至找到平臺為潛伏期,其總行程為游泳距離〔3〕。術(shù)前學(xué)習(xí)5d，每天測試4次，取其平均值，術(shù)后1、3、7d分別進(jìn)行測試，并于術(shù)后7d撤掉平臺，記錄60s內(nèi)大鼠在每個象限的停滯時間和在每個象限游泳的距離。

1.4免疫組化染色

1.4.1灌注和切片大鼠行為學(xué)觀察結(jié)束后，氯胺酮(25mg/kg)腹腔麻醉動物，暴露心臟，以0.9%生理鹽水經(jīng)升主動脈灌注沖洗后，灌注4%多聚甲醛(pH7.4)900ml，持續(xù)2h后取腦，將腦置于20%蔗糖的PBS溶液中浸置24～48h(4℃)，冰凍冠狀連續(xù)切片(厚度30μm)，海馬組織每5張取1張。

1.4.2免疫組化染色步驟切片置于0.3%Triton中浸30min，PBS液洗3次，每次15min;在稀釋濃度為1∶2000的山羊抗ChAT多克隆抗體中孵育72h(4℃);PBS液漂洗后在生物素標(biāo)記二抗(1∶100)中,室溫下孵育1h;辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素(1∶100)中,室溫下孵育1h;二氨基聯(lián)苯氨(DAB)反應(yīng)液中成色,室溫下10～20min;常規(guī)明膠裱片、脫水、DPX封片。為了計算ChAT細(xì)胞數(shù)目，采用標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)格的技術(shù)方法，在100倍的光鏡下做ChAT細(xì)胞計數(shù)，以“500×400μm”為單位，結(jié)果取3個視野的平均值。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法計量資料以x±s表示，用SPSS12.0統(tǒng)計軟件，組間比較采用單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1水迷宮測試結(jié)果術(shù)后1d麻醉組、手術(shù)組的逃避潛伏期和游泳距離延長，與對照組相比均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);術(shù)后3d僅手術(shù)組，石杉堿甲組與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且數(shù)值達(dá)高峰;術(shù)后7d手術(shù)組與對照組比較有差異(P<0.05),但差距已明顯縮小;術(shù)后石杉堿甲組與手術(shù)組比較均有差異(P<0.05)。石杉堿甲組術(shù)前的逃避潛伏期和游泳路程較對照組有明顯差異(P<0.05)，見表1。與對照組(26.5%)、麻醉組(26.3%)、石杉堿甲組(26.5%)比較，術(shù)后7d在60s內(nèi)手術(shù)組(24.1%)的平臺象限停滯時間百分比減小(P<0.05)，與對照組(24.5%)、麻醉組(24.2%)、石杉堿甲組(24.7%)比較，術(shù)后7d在60s內(nèi)手術(shù)組(22.8%)的平臺象限游泳距離占總游泳距離百分比減小(P<0.05)。這些結(jié)果說明脾切除術(shù)后大鼠在水迷宮測試中的空間認(rèn)知能力受到損害，單次使用氯胺酮僅引起極短期的認(rèn)知減退，而石杉堿甲組減弱了脾切除術(shù)后大鼠在水迷宮測試中學(xué)習(xí)記憶能力的損害。表1各組大鼠的逃避潛伏時間、游泳路程1)與對照組比較，2)與手術(shù)組比較：P<0.05

2.2免疫組織化學(xué)結(jié)果術(shù)后7d水迷宮測試后，海馬CA1區(qū)ChAT免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元在對照組、手術(shù)組和石杉堿甲組的表達(dá)率分別是(68.17±3.02)、(80.15±2.18)和(70.31±2.56)，手術(shù)組海馬CA1區(qū)ChAT陽性細(xì)胞數(shù)較對照組、麻醉組(69.04±2.37)和石杉堿甲組都增多(P<0.05),而對照組、麻醉組和石杉堿甲組的ChAT陽性細(xì)胞數(shù)相當(dāng)，見圖1。

3討論

Moller對1218例60歲以上的老年患者進(jìn)行了POCD的調(diào)查研究〔4〕，發(fā)現(xiàn)25.8%的患者在術(shù)后1w出現(xiàn)了POCD，術(shù)后3個月9.9%的患者出現(xiàn)POCD，而相近年齡對照組患者的發(fā)生率分別為3.4%和2.8%，POCD對大多數(shù)患者來說是可逆的，但仍有少數(shù)患者存在長期甚至永久的認(rèn)知功能障礙〔5〕。

脾切除手術(shù)對大鼠的機(jī)體影響較小，術(shù)后大鼠可以如期進(jìn)行水迷宮測試。術(shù)前水迷宮測試成績石杉堿甲組明顯好于其他組，說明石杉堿甲可以改善大鼠的認(rèn)知功能，與以往的文獻(xiàn)報道相符〔4〕。術(shù)后1d，麻醉組、手術(shù)組空間記憶力低于對照組，石杉堿甲組不低于對照組，但呈下降趨勢,表明手術(shù)組學(xué)習(xí)記憶功能下降;術(shù)后3d，麻醉組記憶力恢復(fù)，手術(shù)組、石杉堿甲組進(jìn)一步減退，石杉堿甲組也低于對照組，但石杉堿甲組與手術(shù)組有統(tǒng)計學(xué)差異，提示石杉堿甲具有改善POCD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶的功能;術(shù)后7d，僅手術(shù)組與對照組的差異明顯縮小,提示老年大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力正在恢復(fù)。麻醉組單純應(yīng)用氯胺酮，記憶力僅術(shù)后一天較低，以后恢復(fù)。文獻(xiàn)報道反復(fù)應(yīng)用小劑量氯胺酮可引起認(rèn)知功能障礙〔5〕，單次使用可能僅引起極短期的認(rèn)知減退。

研究表明中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)在學(xué)習(xí)和記憶功能中起主要作用，分布于海馬結(jié)構(gòu)中的膽堿能纖維與學(xué)習(xí)和記憶密切相關(guān)〔6〕，許多年齡相關(guān)的認(rèn)知障礙都有海馬膽堿能系統(tǒng)活力下降,ChAT是中樞神經(jīng)系統(tǒng)合成Ach過程中重要的酶,研究中采用免疫組化技術(shù)觀測了海馬CA1區(qū)ChAT的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)POCD模型大鼠海馬CA1區(qū)ChAT陽性細(xì)胞數(shù)目增多,而研究表明海馬ChAT陽性神經(jīng)元減少與大鼠癡呆發(fā)生密切相關(guān)〔7〕。造成此結(jié)果有兩種可能因素，一是由于機(jī)體為防止輕度認(rèn)知功能障礙加重并轉(zhuǎn)化為永久性癡呆而導(dǎo)致海馬CA1區(qū)ChAT活性上調(diào)〔8〕。另一種因素，可能是POCD大鼠的膽堿能神經(jīng)進(jìn)行了代償性機(jī)能上調(diào)，但這種變化與認(rèn)知功能的具體關(guān)系機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

石杉堿甲生物堿是從蛇足石杉中分離得到的一種新生物堿,是一種高效可逆的膽堿酯酶抑制劑,其改善、促進(jìn)學(xué)習(xí)、記憶過程的作用已有定論〔2〕。研究〔9〕表明，石杉堿甲對成年、老年嚙齒類動物及老年猴有促智作用，石杉堿甲改善學(xué)習(xí)、記憶的作用呈典型的鐘形量效關(guān)系，劑量過大則損害記憶功能。給予石杉堿甲0.01～0.50mg·kg-1·d-1，均能明顯增強(qiáng)實驗動物的學(xué)習(xí)、記憶功能。因此選擇石杉堿甲灌胃，0.15mg·kg-1·d-1,為確保療效連續(xù)用藥3w〔10〕。超級秘書網(wǎng)

乙酰膽堿是腦內(nèi)廣泛分布的重要神經(jīng)遞質(zhì)，主要參與記憶與認(rèn)知功能。老年大鼠的皮層膽堿能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)密度降低，在非病理性老化中都不同程度存在腦中乙酰膽堿生成和釋放的減少，因此全麻手術(shù)后早期譫妄好發(fā)于老年大鼠。本實驗結(jié)果提示石杉堿甲的干預(yù)穩(wěn)定了海馬膽堿能系統(tǒng)，改善了POCD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶的功能。

綜上所述，老年大鼠脾切除手術(shù)后早期可發(fā)生認(rèn)知功能障礙，并在術(shù)后3d左右達(dá)高峰，以后逐漸恢復(fù)，單次使用氯胺酮僅引起極短期的認(rèn)知減退，預(yù)先給予石杉堿甲能夠減輕大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的損害。

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