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【摘要】目的觀察腦心康片對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。方法采用大鼠大腦中動(dòng)脈線栓法制備不完全腦缺血模型，觀察腦心康片給藥前后大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)大鼠神經(jīng)功能缺損導(dǎo)致的行為學(xué)變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腦心康片對(duì)MCAO模型大鼠急性腦損傷細(xì)胞凋亡的影響；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腦心康片對(duì)腦缺血后24，48，72h腦組織COX2蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果大鼠腦缺血再灌注損傷后24，48，72h腦組織中COX2陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度值及神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率模型組與假手術(shù)組相比，差異有顯著意義（P<0.01）；給藥后腦心康高、中、低劑量組與銀杏葉片組相比，差異有顯著意義（P<0.01或P<0.05）；給藥后腦心康高、中、低劑量組與尼莫地平組相比，差異有顯著意義（P<0.01或P<0.05）。結(jié)論腦心康片對(duì)腦缺血具有保護(hù)作用，并遵循一定的時(shí)效關(guān)系和量效關(guān)系，其機(jī)制可能與降低缺血腦組織神經(jīng)元的凋亡率，抑制COX2蛋白的表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】腦心康片；腦缺血；再灌注損傷；細(xì)胞凋亡；COX2

腦血管疾病是神經(jīng)系統(tǒng)的常見(jiàn)病、多發(fā)病，是目前引起人類死亡的三大疾病之一。缺血性腦卒中是多種原因引起的一種臨床病理狀態(tài),其腦組織損害是產(chǎn)生臨床征象的病理基礎(chǔ)。在本病的預(yù)防、治療和康復(fù)方面，中醫(yī)藥具有較為顯著的療效和優(yōu)勢(shì)［1］。臨床應(yīng)用腦心康片治療腦缺血，取得滿意療效。本文旨在通過(guò)對(duì)大鼠腦神經(jīng)損傷的行為學(xué)改變、細(xì)胞凋亡率和凋亡相關(guān)基因COX2蛋白表達(dá)的觀察，探討腦心康片對(duì)腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用及其作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1材料

1.1動(dòng)物Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：黑動(dòng)字P00101006。大鼠自由進(jìn)食、飲水，同等條件下飼養(yǎng)，手術(shù)前12h禁食，不禁水。

1.2藥品與試劑腦心康片由蝙蝠葛酚性堿50%、水蛭素50%組成，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心制備。尼莫地平片，天津中央藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。銀杏葉片，唐山榮大藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。COX2抗體（COX2山羊抗兔IgG多抗）稀釋度：1:100，SantaCruz公司。HRP標(biāo)記的鏈霉卵白素-親和素SP試劑盒、S/P兩步法檢測(cè)試劑盒、PV6001二步法檢測(cè)試劑盒、兔抗山羊IgG/HRP、山羊抗鼠IgG/HRP，DAB顯色試劑盒，均由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

2方法

2.1分組及給藥方法Wistar大鼠雄性70只，體質(zhì)量（200±20）g，按照體質(zhì)量隨機(jī)分為7組，每組10只。即腦心康片高劑量組（100mg/kg）、腦心康片中劑量組（50mg/kg）、腦心康片低劑量組（25mg/kg）、尼莫地平組（21.6mg/kg）、銀杏葉片組（135mg/kg）、模型對(duì)照組和假手術(shù)組（分別給等體積生理鹽水）。各組均連續(xù)灌胃給藥7d，末次給藥30min后手術(shù)。

2.2大鼠腦缺血再灌注模型制備采用大鼠大腦中動(dòng)脈線栓法制備不完全腦缺血模型，末次給藥30min后，20%烏拉坦（1g/kg，ip）麻醉，分離并結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈及迷走神經(jīng)45min，然后松開(kāi)再灌注2h。假手術(shù)組只暴露血管不結(jié)扎，其余組均按照上述過(guò)程操作。

2.3實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的檢測(cè)方法在造模手術(shù)完成3～5h，待大鼠蘇醒后，能夠完全自主活動(dòng)時(shí)，進(jìn)行第1次神經(jīng)功能評(píng)分；分別于末次給藥后24，48，72h進(jìn)行第2次神經(jīng)功能評(píng)分。行為學(xué)評(píng)分后處死動(dòng)物，迅速取出大腦置于冰盤(pán)上。將大腦分成兩半，取左側(cè)大腦皮層腦組織2g制成單細(xì)胞懸液，檢測(cè)大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率。取右側(cè)大腦制成1%的腦組織勻漿，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠腦組織COX2蛋白表達(dá)。

2.4統(tǒng)計(jì)方法所有數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)。

3結(jié)果

3.1腦心康片給藥前后各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分情況

結(jié)果見(jiàn)表1。表1各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分的基本情況（略）

由表1可見(jiàn)，模型組與假手術(shù)組相比，差異有顯著性意義（P<0.01），說(shuō)明造模是成功的。經(jīng)藥物治療后，藥物治療各組的大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分積分治療前與治療后比較，及藥物治療后的神經(jīng)功能缺損評(píng)分積分與模型組的比較，均具有極顯著差異，P＜0.01，說(shuō)明各治療藥物對(duì)腦缺血均具有顯著的治療作用，能明顯改善神經(jīng)功能缺損，使大鼠因腦缺血導(dǎo)致的行為障礙得到部分改善，但還未達(dá)到完全恢復(fù)的程度，即與假手術(shù)組比較，P＜0.01。且72h腦心康片治療組的療效優(yōu)于24h治療組（高劑量），差異顯著，P＜0.05，說(shuō)明腦心康片對(duì)腦缺血的保護(hù)作用存在著一定的時(shí)效關(guān)系。

3.2腦心康片對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

結(jié)果見(jiàn)表2。表2腦心康片對(duì)MCAO大鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響（略）

由表2可見(jiàn)模型組與假手術(shù)組比較有顯著性差異，P＜0.01，說(shuō)明造模是成功的。所有藥物治療組與假手術(shù)組比較，均有顯著性差異，P＜0.01，與模型組比較差異亦顯著，P＜0.01或P＜0.05。假手術(shù)組腦組織的神經(jīng)細(xì)胞可測(cè)得凋亡峰，即細(xì)胞凋亡率不為0，說(shuō)明正常的腦組織亦有少量的凋亡現(xiàn)象發(fā)生。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腦心康片具有明顯的抗腦缺血作用，對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡具有明顯的抑制作用，隨劑量增加，此作用明顯增強(qiáng)。腦心康片高劑量抗腦缺血的作用要優(yōu)于銀杏葉片，與尼莫地平作用相當(dāng)，中劑量弱于尼莫地平，但與銀杏葉片作用相當(dāng)，低劑量弱于尼莫地平和銀杏葉片。

3.3腦心康片對(duì)MCAO大鼠腦組織COX2表達(dá)的影響

結(jié)果見(jiàn)表3。表3腦心康片對(duì)MCAO大鼠腦組織COX2表達(dá)的影響（略）

由表3可見(jiàn)，經(jīng)藥物治療后，各組的大鼠腦組織雖可見(jiàn)COX2陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，但與模型對(duì)照組比較，均具有極顯著差異，P＜0.01，說(shuō)明各治療藥物對(duì)腦缺血均具有顯著的治療作用，能明顯抑制COX2表達(dá)，且腦心康片同一時(shí)間點(diǎn)的高、低劑量組比較差異顯著，P＜0.01；72h腦心康片治療組的療效優(yōu)于24h腦心康片治療組（高劑量），差異顯著，P＜0.05，說(shuō)明腦心康片對(duì)腦缺血的保護(hù)作用存在著一定的量效關(guān)系和時(shí)效關(guān)系。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在缺血早期，腦心康片具有明顯的抗腦缺血、抑制COX2表達(dá)的作用，并存在一定的量效關(guān)系及時(shí)效關(guān)系。

4討論

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞接受導(dǎo)致凋亡的“信號(hào)”時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)被激活，啟動(dòng)內(nèi)部自身基因調(diào)控機(jī)制，引起細(xì)胞自殺性死亡［2］。近年來(lái)日益增多的證據(jù)表明，神經(jīng)元凋亡參與缺血性細(xì)胞損傷，并且是缺血引起選擇性神經(jīng)元丟失的一種重要形式。腦缺血后，細(xì)胞因Glu受體過(guò)量激活、鈣超載、炎癥變化、OFR、線粒體和DNA損傷而表現(xiàn)出壞死或凋亡兩種死亡形式。在缺血中心區(qū)主要以壞死為主，而在缺血半暗帶以凋亡為主；輕度缺血主要引起細(xì)胞凋亡，嚴(yán)重缺血主要引起細(xì)胞壞死。局灶性腦缺血發(fā)生后神經(jīng)元的死亡有兩種不同的方式：細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡，并且兩種方式可以并存［3］。

環(huán)氧合酶（COX）是催化花生四烯酸合成前列腺素和血栓素的限速酶，能引起炎癥反應(yīng)并導(dǎo)炎癥細(xì)胞毒性。其活性在控制前列腺素類物質(zhì)的合成過(guò)程中有著重要作用。越來(lái)越多的證據(jù)表明COX參與了缺血性腦損傷，是核因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶目標(biāo)之一。在正常情況下，成年動(dòng)物腦內(nèi)不表達(dá)COX-2，在缺血和缺氧引起的炎癥反應(yīng)中，COX2表達(dá)增高，主要在神經(jīng)元和血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)［4］。COX-2在神經(jīng)組織中的表達(dá)可直接損傷神經(jīng)元，并可能引起組織損傷和腦水腫［5］。由于COX2參與了腦缺血后神經(jīng)元損傷的病理過(guò)程，因此阻斷或減少COX2激活，降低COX2表達(dá)，皆可減輕由caspase3介導(dǎo)的缺血性神經(jīng)元損害。COX2抑制劑可顯著抑制缺血易損傷區(qū)COX2的活性，抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，改善神經(jīng)功能。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腦心康片具有明顯的抗腦缺血作用，對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡具有明顯的抑制作用，隨劑量增加，此作用明顯增強(qiáng)。腦心康片高劑量抗腦缺血的作用要優(yōu)于銀杏葉片，與尼莫地平作用相當(dāng)，中劑量弱于尼莫地平，但與銀杏葉片作用相當(dāng)，低劑量弱于尼莫地平和銀杏葉片；腦心康片具有明顯抑制缺血腦組織COX2表達(dá)的作用，減輕局灶性腦缺血時(shí)的炎癥反應(yīng)及繼發(fā)引起的遲發(fā)性神經(jīng)元損害作用，并存在一定的量效關(guān)系及時(shí)效關(guān)系。超級(jí)秘書(shū)網(wǎng)：

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