前言：本站為你精心整理了探究酵母菌克隆的制備方法范文，希望能為你的創(chuàng)作提供參考價值，我們的客服老師可以幫助你提供個性化的參考范文，歡迎咨詢。

1方法

白假絲酵母菌總DNA提取將白假絲酵母菌SC5314株接種于馬鈴薯斜面培養(yǎng)基，37℃孵育48h，挑選數(shù)個大的、新鮮培養(yǎng)的克隆，通過玻璃珠法提取白假絲酵母菌總DNA。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增SAP2目的片段查找GenBank中白假絲酵母菌SC5314株的SAP2核苷酸序列根據(jù)SAP2的編碼序列和原核表達載體pMAL－c2x序列的酶切位點設(shè)計引物，上游引物：下游引物：劃線部分為EcoRⅠ、SalⅠ酶切位點，斜體部分為保護性堿基）。以白假絲酵母菌SC5314的全基因組DNA為模板，根據(jù)以上引物，利用合成酶進行PCR擴增，獲得SAP2目的片段（169～1194bp）。PCR條件為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min，4℃貯存PCR產(chǎn)物。采用柱式膠回收，PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收及純化SAP2目的片段。質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定將含有pMAL－c2x的E接種至液體培養(yǎng)基中于37℃劇烈振搖（200r／min）培養(yǎng)過夜增菌，用SDS堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。將純化的SAP2基因片段與原核表達質(zhì)粒pMAL－c2x在37℃下經(jīng)過EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切2h。雙酶切產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下收取雙酶切目的片段及質(zhì)粒，用DNA片段玻璃奶快速回收至純化試劑盒純化雙酶切產(chǎn)物。按載體DNA與插入DNA片段的比例估算出連接中各自DNA加入的量，在T4DNA連接酶的作用下，充分混勻，16℃過夜連接，連接產(chǎn)物4℃保存。用CaCl2法制備并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆菌提質(zhì)粒，進行酶切鑒定和測序分析。少量IPTG誘導(dǎo)表達將重組原核表達載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞挑取單菌落至3mLAmprLB培養(yǎng)基中，蔗糖37℃劇烈振蕩過夜培養(yǎng)，次日分別取150μL過夜培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)接于2支含5mLAmprLB培養(yǎng)基的試管中，37℃振蕩繼續(xù)培養(yǎng)0．8時，向其中一支試管中加入IPTG至終濃度，以16℃繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)14h，同時設(shè)不加IPTG誘·242·中國感染控制雜志2013年7月第12卷第4期導(dǎo)的菌液為對照組。4000r／min離心10min收集菌體沉淀，重懸于1mL的PBS中，誘導(dǎo)組利用超聲破碎儀破菌，并在，4℃離心樣品20min，留取誘導(dǎo)上清及誘導(dǎo)沉淀樣品。最后取10μL留取的樣品，加入中，混勻后煮沸20min，冷卻后離心，采用SDS－PAGE電泳檢測目的蛋白的表達情況。大量誘導(dǎo)表達目的蛋白按照試表達的條件擴大培養(yǎng)基至1L，其余條件同上。目的蛋白純化從4℃冷柜中取出裝入的層析柱中，自然沉降后裝好柱頭，利用平衡緩沖液，平衡約9個柱體積，超聲破碎后離心上清上柱，控制流速1mL／min，流穿樣品收集后再次上柱，重復(fù)3次，以確保蛋白與層析柱充分結(jié)合。用平衡緩沖液沖洗純化柱約12個柱體積，至檢測不到蛋白洗出為止。取出介質(zhì)（10mL）裝入50mL離心管中，加入300μLXa因子封好管口后，置于靜音螺旋混合儀上，4℃混合過夜酶切。酶切后的介質(zhì)重新裝柱，收集流穿，再用平衡緩沖液沖洗約2個柱體積收集流穿液，即為酶切后目的蛋白。

2鼠抗血清制備

取可溶性Sap2蛋白用PBS稀釋后配制成0．5mg／mL溶液，初次免疫時，將等量rSap2和弗氏完全佐劑各500μL混合后充分乳化。選取9只6周齡BLAB／c小鼠，經(jīng)左／右側(cè)后肢脛前肌注射rSap2蛋白，初次免疫劑量為每只50μg。初次免疫后第14、21、28d加強免疫，免疫劑量為每只25μg，共加強免疫3次。加強免疫時與弗氏不完全佐劑1∶1混勻，方法同上。末次免疫后7d采尾靜脈血L，并以離心5min，獲取血清約30～50μL，采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）測定效價。間接ELISA法測定抗血清效價用包被緩沖液將rSap2稀釋至終濃度5μg／mL，加入96孔酶標(biāo)板中，每孔100μL，4℃過夜。PBST洗板3次，加孔封閉液，37℃封閉洗板3次，將抗血清倍比稀釋，稀釋比例依次為51200，每孔100μL，37℃孵育1h。同時用PBS作空白對照，正常小鼠血清作陰性對照。洗板4次。取辣根酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG按稀釋后，每孔孵育30min，滌4次。每孔加入100μLTMB底物緩沖液，37℃顯色15min后，每孔加入50μL終止液將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀，以450nm單波長測定各孔OD值，以1倍陰性對照孔的血清最高稀釋倍數(shù)作為抗血清ELISA效價?？寡宓募兓瘜⒖寡逵肞BS稀釋4倍，0．45μm微孔濾膜過濾備用。準(zhǔn)備親和層析填料，裝入層析柱，利用10倍于床體積并經(jīng)過預(yù)冷的PBS緩沖溶液平衡親和柱至基線平穩(wěn)，將流速調(diào)整為，并將預(yù)裝柱與蠕動泵和檢測儀、記錄儀連接好，注意避免氣泡進入。按1mL／min流速，將抗血清樣品上柱，收集流穿液；將流穿液再次上柱，繼續(xù)平衡至基線平穩(wěn)。加入2倍柱體積的pH2．7甘氨酸洗脫液洗脫，夾住流出管，靜置5min后收集洗脫液，重復(fù)3次。之后立即加入的中和緩沖液，使其pH值接近7．0。用結(jié)合液沖洗柱子至pH值與結(jié)合液相同，再用PBS平衡至基線。用BCA法測定純化后多克隆抗體的濃度。1．2．9鼠抗rSap2多克隆抗體的特異性鑒定將可溶性Sap2蛋白上樣5μg行SDS－PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后將抗Sap2多克隆抗體1∶高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒顯色，行免疫印跡）分析。

3結(jié)果

目的片段PCR擴增SAP2目的片段，1％瓊脂糖凝膠電泳顯示，在約處有一清晰條帶，與預(yù)期分子量大小一致。重組載體的酶切鑒定結(jié)果酶切后，質(zhì)粒DNA在凝膠上出現(xiàn)一條與質(zhì)粒大小相符的條帶和一條與SAP2基因片段大小相符的條帶。以上，以免疫前小鼠血清作為陰性對照，顯色呈陰性，表明rSap2蛋白免疫小鼠產(chǎn)生了較高滴度的抗體。

作者：仇萌鄒先彪李蕾單位：中國人民解放軍總醫(yī)院