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1材料與方法

4～6周齡的清潔級(jí)家兔由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所動(dòng)物場提供。莫氏巴貝斯蟲裂殖子的純化與總RNA的提取莫氏巴貝斯蟲臨潭株單克隆株G7由蘭州獸醫(yī)研究所蟲媒與蟲媒傳播病課題組提供。莫氏巴貝斯蟲的體外培養(yǎng)參照文獻(xiàn)進(jìn)行，當(dāng)染蟲率達(dá)到8％～10％時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)物，利用滲透壓差法進(jìn)行裂殖子的純化［15］。向100μL裂殖子中加入反復(fù)吹打以破碎細(xì)胞，加入200μL氯仿，12000×g離心10min。上層水相轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，加入500μL異丙醇，室溫靜置10min，4℃12000×g離心10min。棄去上清，總RNA沉淀用750mL／L的乙醇洗滌1次，置于超凈臺(tái)內(nèi)吹干。最后用20μL無RNA酶的去離子水溶解，用微量核酸蛋白檢測儀測定濃度，并對(duì)其進(jìn)行凝膠電泳分析。1．3全長基因的RACE擴(kuò)增根據(jù)GenBank中公布的頂復(fù)門原蟲相關(guān)基因序列，在基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)RACE擴(kuò)增引物，進(jìn)行基因的5′RACE和3′RACE擴(kuò)增，引物序列。RACE操作按照說明進(jìn)行。擴(kuò)增的RACE產(chǎn)物插入到pGEM－TEasy載體，轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞中，通過藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定為陽性的菌落，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。獲得的測序結(jié)果應(yīng)用DNAStar軟件進(jìn)行序列拼接和開放閱讀框預(yù)測。全長CDS的PCR擴(kuò)增與基因結(jié)構(gòu)分析actin，aldolase和trap基因全長的擴(kuò)增引物根據(jù)RACE的測序結(jié)果，在預(yù)測的開放閱讀框外側(cè)設(shè)計(jì)上游引物和下游引物，引物序列。分別以莫氏巴貝斯蟲cDNA和基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收后，克隆至pGEM－TEasy載體，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。原核表達(dá)載體的構(gòu)建與融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)根據(jù)全長基因的測序結(jié)果，利用PrimerPre－mier5．0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物序列見，下劃線處為酶切位點(diǎn)。以莫氏巴貝斯蟲臨潭株G7cD－NA為模板，進(jìn)行基因的擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后，酶切產(chǎn)生具有黏性末端的基因分別與pGEX－4T－1載體的酶切產(chǎn)物連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E．coilJM109感受態(tài)細(xì)胞中。用含氨芐青霉素的LB平板篩選陽性菌落。經(jīng)PCR鑒定為陽性的重組原核表達(dá)載體，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序驗(yàn)證。將測序驗(yàn)證正確的原核表達(dá)載體分別命名為，重組表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）pLysS感受態(tài)細(xì)胞中，37℃、200r／min培養(yǎng)至D600nm達(dá)到0．6～0．8時(shí)，加入IPTG使其終濃度為0．8mmol／L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4h。4℃、3900×g離心10min，收集細(xì)菌沉淀，純化融合蛋白，操作步驟按說明書進(jìn)行。分析表達(dá)的重組蛋白，用微量核酸測定儀測定蛋白的質(zhì)量濃度?？寡宓闹苽洹⑻禺愋詸z測及效價(jià)測定融合蛋白免疫家兔前耳緣靜脈采血作為陰性血清。純化的融合蛋白和分別與等量的佐劑乳化后，以皮下多點(diǎn)注射法免疫家兔制備多克隆抗體。初次免疫時(shí)，每只家兔注射200μg，此后以100μg／只注射；每2周免疫1次，共免疫3次。初次免疫使用弗氏完全佐劑，加強(qiáng)免疫使用弗氏不完全佐劑。末次免疫10d后，耳緣靜脈采血，分離抗血清進(jìn)行抗體效價(jià)與反應(yīng)性測定。用ELISA方法測定抗體效價(jià)，分別以純化的融．1RACE擴(kuò)增RACE擴(kuò)增獲得的和trap基因片段，經(jīng)10g／L的瓊脂糖凝膠電泳檢測。將上述基因5′和3′末端序列的測序結(jié)果進(jìn)行裝配、BLAST分析，

2結(jié)果

基因結(jié)構(gòu)分析擴(kuò)增的基因全長分別為1110、1199和2254bp，開放閱讀框大小分別為。將獲得的基因用BLAST／P軟件進(jìn)行同源性分析、開放閱讀框預(yù)測及基因特性分析，結(jié)基因沒有內(nèi)含子。trap基因由4個(gè)內(nèi)含子和5個(gè)外顯子組成，內(nèi)含子長度分別為39、36、38和37bp。并將所獲的aldolase基因序列登錄GenBank／NCBI，獲取登錄號(hào)。融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白分子質(zhì)量大小約為，與預(yù)期融合蛋白的大小基本一致。利用純化融合蛋白，結(jié)果見圖4。經(jīng)微量核酸蛋白測定儀測得蛋白的質(zhì)量濃度分別為。純化的融合蛋白經(jīng)GST標(biāo)簽抗體識(shí)別，在預(yù)期大小的目的蛋白處出現(xiàn)單一條帶。結(jié)果表明，純化獲得了正確的融合蛋白，可以用于后續(xù)的家兔免疫制備多克隆抗體。多克隆抗體的鑒定及效價(jià)測定分別以純化的融合蛋白樣品GST－Actin、GST－Aldolase、GST－TRAP為抗原，獲得的家兔免疫血清為一抗（血清用大腸桿菌裂解物和GST蛋白中和處理后，經(jīng)ELISA驗(yàn)證該血清與大腸桿菌菌體蛋白和GST不發(fā)生反應(yīng)），分別用HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和AP標(biāo)記的鼠抗兔IgG為二抗，進(jìn)行ELISA和Western－blot鑒定。結(jié)果分別出現(xiàn)了分子質(zhì)量大小約74ku、76ku和118ku的單一條帶（見圖6），說明獲得的多克隆抗體具有良好的特異性。用免疫前的家兔血清作為對(duì)照，陽性血清用間接ELISA測定抗體效價(jià)。結(jié)果顯示免疫后抗血清的效價(jià)均高于1∶12800。

3討論

頂復(fù)門原蟲的醛縮酶具有雙重功能；一是催化糖酵解和糖異生，二是介導(dǎo)肌動(dòng)蛋白絲與跨膜蛋白的相互作用，即把參與細(xì)胞黏附、滑行運(yùn)動(dòng)和入侵相關(guān)的微線體蛋白（MIC）錨定在肌動(dòng)蛋白馬達(dá)上，從而使微線體蛋白可以與宿主細(xì)胞表面的受體相互作用。因此醛縮酶被認(rèn)為是抗寄生蟲感染藥物設(shè)計(jì)的分子靶位，此外醛縮酶還可以作為瘧疾的潛在診斷抗原。在瘧原蟲、弓形蟲的子孢子、牛巴貝斯蟲、吉氏巴貝斯蟲、隱孢子蟲和艾美耳球蟲中都發(fā)現(xiàn)了TRAP家族蛋白。TRAP在多種頂復(fù)門原蟲的入侵中起重要作用。大多數(shù)TRAP家族蛋白都具有整合素A樣結(jié)構(gòu)域和TSR結(jié)構(gòu)域；寄生蟲利用該結(jié)構(gòu)域結(jié)合紅細(xì)胞表面受體、多糖和磷脂樣分子。瘧原蟲子孢子TRAP蛋白的TSR和A結(jié)構(gòu)域結(jié)合肝細(xì)胞表面的硫酸肝素糖蛋白，當(dāng)TSR或A結(jié)構(gòu)域失活后，子孢子的入侵受阻，但不影響其滑行運(yùn)動(dòng)。因此，trap可能是疫苗設(shè)計(jì)的靶基因。在瘧原蟲中可以作為候選診斷抗原。本研究中所克隆的基因和制備的多克隆抗體，為開展莫氏巴貝斯蟲的滑行運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞入侵方面的研究奠定了基礎(chǔ)，為巴貝斯蟲病血清學(xué)診斷技術(shù)的建立提供了候選抗原，同時(shí)也為預(yù)防和治療抗巴貝斯蟲病藥物的設(shè)計(jì)提供了候選靶位。

作者：王錦明楊吉飛李安巖單位:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院