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作者：曹偵馮廣朋莊平王慧王瑞芳章龍珍單位：中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院華東師范大學生命科學學院

1材料與方法

1.1材料來源與血清采集實驗用蟹來源于2010年12月長江口(上海寶楊碼頭)增殖放流的中華絨螯蟹親蟹。放流親蟹為人工繁育與養(yǎng)殖的中華絨螯蟹,共3萬只,雌雄比例為3∶1,生長環(huán)境為露天土池塘,水草覆蓋率在50%以上。其中5000只標志,標志方法為在親蟹右邊螯足上套上專用套環(huán)并在其甲殼背面下方貼上防偽標簽。放流親蟹通過絲網(wǎng)回捕,網(wǎng)目大小為10cm,網(wǎng)高1.5m。每天回捕放流親蟹的時間根據(jù)當天落潮的時間而定,落潮將要結(jié)束的時候拉起網(wǎng)具。每次拉網(wǎng)的時候記錄親蟹總數(shù)、標志蟹數(shù)量和水文(水溫、鹽度、pH等)等數(shù)據(jù)。對每次回捕到的標志親蟹均詳細記錄形態(tài)學數(shù)據(jù)(體重、殼長、殼寬等)并取樣,當每次回捕親蟹的數(shù)量小于20只時全部取樣,如多于20只則隨機取20只親蟹樣本。將親蟹用冰麻醉15—20min后,取出擦干體表水分,快速測量其體質(zhì)量、殼長和殼寬。然后用一次性注射器于蟹第三步足基部血竇處抽取血淋巴2mL,在4℃、3000r/min的條件下離心20min,取上層血清存于Eppendorf離心管中,存放于?20℃冰箱中,用于各項血液指標的測定。然后在裝滿碎冰的冰盤上快速解剖親蟹,取其肝胰腺存于Eppendorf離心管中,保存于?80℃冰箱中備用。為盡量減少長江口復雜環(huán)境因素變化對放流親蟹生理生化等指標的干擾,實驗選取回捕位置相對比較集中(31°12.776′N—31°10.570′N,121°49.200′E—121°50.800′E)、回捕數(shù)量較多的同一區(qū)域不同時間內(nèi)回捕到的標志蟹的樣品進行各項指標測定,共77只(表1),按回捕日期距放流時間(d)分組,將放流前的中華絨螯蟹組記為0d。各組蟹的回捕位置、樣本量、規(guī)格及水文情況(表1)。

1.2測定指標及其測定方法用深圳邁瑞MINDRAYBS-200全自動生化分析儀測定血清中總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、堿性磷酸酶(ALP)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、肌酐(CREA)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)的活性或含量。先將欲測的指標定標校準,然后按照生化分析儀操作說明和配套試劑盒測試流程進行測定,其中TP、ALB、TC、TG采用終點法,ALP、ALT、AST采用動力學法,CREA采用固定時間法。血清中血藍蛋白含量的測定參照Chen,etal.[14],通過UNICOUV-2802S紫外分光光度計測得,血藍蛋白含量(mmol/L)=(A×R)/(ε×S×P),式中:A為分光光度計測得的吸光度值;R為反應液的總體積(μL);ε為消光系數(shù);S為待測樣品的體積(μL);P為分光光度計中光穿透長度(cm)。肝胰腺中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)的活性采用采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定,嚴格按照對應試劑盒中的操作流程進行測定。

1.3統(tǒng)計分析實驗結(jié)果均用平均值±標準差(Mean±SE)表示,采用SPSS18.0進行數(shù)據(jù)處理,處理時對各指標數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗,若具有方差齊性,則按照單因素方差分析(ANOVA),LSD檢驗法進行組間數(shù)值多重比較;若不具有方差齊性,則按照單因素方差分析(ANOVA),Dunnett’sT3檢驗法進行組間均值多重比較。P<0.05表示差異顯著,P>0.05表示差異不顯著。

2結(jié)果

2.1抗氧化酶、磷酸酶和轉(zhuǎn)氨酶的變化中華絨螯蟹親蟹肝胰腺中SOD和CAT的活性在放流后均呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢,且均在放流后9d活性最低,其中,肝胰腺中SOD的活性在放流后9d較放流前顯著降低(P<0.05)(表2)。放流后70d及79d肝胰腺SOD的活性較放流前顯著升高(P<0.05),而CAT活性放流前后變化不顯著(P>0.05)。放流親蟹肝胰腺中ACP的活性在放流后出現(xiàn)升高的趨勢,到6dACP活性較高,但與放流前相比差異不顯著(P>0.05),而后開始降低(表2)。在放流后13d降到最低并顯著低于放流前(P<0.05),而后又開始升高,在22d達到放流前水平。放流后70d到79d有下降趨勢,但均與放流前差異不顯著(P>0.05)。在親蟹血清中ALT、AST和ALP的活性在放流后的變化趨勢總體一致,在放流后9d均達到最高值且顯著高于放流前(P<0.05),而后開始下降(表3)。放流后79d,血清中三者活性基本恢復至放流前水平(P>0.05)。

2.2蛋白質(zhì)、脂類和肌酐的變化在親蟹血清中TP的含量呈先升高后降低趨勢,在6d達到最大值,而后下降,22d以后TP含量顯著低于放流前(P<0.05)(表4)。在血清中ALB的含量在放流后總體呈現(xiàn)先升后降的趨勢,放流后13d左右其含量最高,且與放流前差異顯著(P<0.05),而后下降,放流后70d左右血清中ALB的含量較放流前顯著降低(P<0.05)。血藍蛋白的含量呈波動性變化,放流后血藍蛋白出現(xiàn)明顯下降(P<0.05),9d恢復至放流前水平,13d后血清血藍蛋白含量趨于穩(wěn)定并顯著低于放流前含量(P<0.05)。在放流中華絨螯蟹血清中TC的含量大體上也呈現(xiàn)先升后降的趨勢,放流后6dTC含量顯著升高(P<0.05),9d開始下降,70d以后雄蟹血清中的TC含量較放流前顯著降低(P<0.05)(表4)。在血清中TG的含量在放流后開始下降,放流后9d左右TG含量最低且較0d差異顯著(P<0.05),13d和22d基本恢復至0d的水平(P>0.05),到70d左右最終趨于穩(wěn)定,但放流前顯著降低(P<0.05)。在親蟹血清中CREA含量在放流后呈現(xiàn)波動變化,放流后13d其含量較放流前顯著升高(P<0.05),在70d和79d親蟹血清中CREA含量均較放流前差異不顯著(P>0.05)(表4)。

3討論

3.1中華絨螯蟹親蟹放流后抗氧化能力變化SOD和CAT是生物體內(nèi)的兩種抗氧化的主要酶類,它們可以相互配合清除生物體內(nèi)的活性氧自由基。SOD可以阻止氧自由基對細胞的損害、修復受損細胞并能通過反應將氧自由基轉(zhuǎn)化成過氧化氫,而CAT可以將同樣對機體有害的過氧化氫分解成對生物體無害的水和氧。因此SOD和CAT常被用作判斷生物體非特異性免疫的能力的指標[15—17]。實驗發(fā)現(xiàn),在中華絨螯蟹親蟹肝胰腺中SOD和CAT活性在放流后的9d內(nèi)持續(xù)降低,13d后出現(xiàn)升高趨勢,并在22d恢復至放流前水平,這可能說明中華絨螯蟹親蟹的非特異性免疫能力在放流后降低,在22d左右恢復至放流前水平。放流后70d和79d親蟹的SOD和CAT的活性表明放流親蟹的非特異性免疫能力較放流前恢復并加強。從捕獲放流親蟹位置的水文信息可以得出,親蟹SOD和CAT的這種變化應該跟環(huán)境,脅迫有主要關系。環(huán)境脅迫能夠促使生物體機體細胞內(nèi)的線粒體、微粒體以及胞漿的酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)反應,產(chǎn)生活性氧和氧自由基,從而打破生物機體內(nèi)的活性氧代謝平衡,使生物體面臨活性氧傷害[18]。洪美玲等[19]研究發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹受溫度脅迫1d后血淋巴中SOD和CAT活力出現(xiàn)不同程度下降;陳宇鋒等[20]研究發(fā)現(xiàn)青蟹肝胰腺中SOD活動隨鹽度脅迫時間的延長出現(xiàn)先降后升趨勢;還有研究發(fā)現(xiàn)機體新陳代謝速度加快會使機體自身抗氧化系統(tǒng)受到影響,從而產(chǎn)生大量的活性氧[11]。在實驗中中華絨螯蟹親蟹肝胰腺SOD和CAT活性在放流后出現(xiàn)降低趨勢,應該是親蟹在向咸淡水交匯處洄游過程中受到溫度[21,22]、鹽度等環(huán)境因子的脅迫和蟹體通過加快自身新陳代謝來減少應激共同作用的結(jié)果。中華絨螯蟹親蟹在放流9d后肝胰腺中SOD活性最低,這與陳宇鋒等[20]發(fā)現(xiàn)的青蟹經(jīng)鹽度應激3d后肝胰腺中SOD活性最低的結(jié)果相似。

3.2中華絨螯蟹親蟹放流后血清磷酸酶、氨基轉(zhuǎn)移酶的變化ALP和ACP是甲殼動物體內(nèi)兩種重要的磷酸酶,它們在機體內(nèi)能夠直接參與磷酸基團的轉(zhuǎn)移和代謝,加速機體內(nèi)物質(zhì)的攝取和轉(zhuǎn)運,并能形成水解酶體系,破壞和消除入侵機體的異物,因此對維持蝦、蟹類的生存和生長具有重要的意義[23—26]。研究發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹親蟹血清ALP和肝胰腺ACP活性在放流后出現(xiàn)升高,13d后開始下降,其中ACP活性在22d基本恢復至放流前水平,而ALP活性在79d恢復至放流前水平。這可能是由于蟹進入新環(huán)境后,必須通過加速物質(zhì)的攝取和轉(zhuǎn)運來提高自身的代謝速度,減緩環(huán)境對自身的應激,而隨著蟹對新環(huán)境的適應,蟹血清中ALP和肝胰腺中ACP活性也慢慢下降。在放流后13d,蟹肝胰腺中的ACP較放流前顯著降低,推測這與ACP是巨噬細胞溶酶體的標志酶有關[24],ACP活性較放流前降低反映此時親蟹免疫力有所下降,這跟SOD和CAT活性變化反映出來的機體的抗氧化能力、免疫力下降的結(jié)果一致。研究表明中華絨螯蟹放流親蟹在放流后體內(nèi)磷酸基團的轉(zhuǎn)移和代謝增強,破壞和清除入侵異物的能力升高,而基本恢復至放流前水平可能需要22d左右,其中親蟹血清ALP活性要比肝胰腺中ACP活性恢復得慢。ALT和AST是兩種重要的氨基轉(zhuǎn)移酶,主要存在于肝臟和心肌細胞中,在血清中濃度較低。當機體肝細胞或某些組織受損害時,血清中的這兩種酶的活性就會升高[27,28]。研究發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹親蟹在放流后血清中ALT和AST活性升高,9d后兩者的活性最高,放流22d后ALT活性恢復至放流前水平,而AST活性在79d恢復至放流前水平。初步推測這可能是親蟹由于受到環(huán)境應激導致組織受損,而隨著親蟹不斷對環(huán)境的適應,自身受損的組織逐步恢復。本研究表明中華絨螯蟹親蟹在放流后蟹體肝細胞或其他組織受損,在放流后9d可能受損最嚴重,22d左右親蟹肝細胞或其他組織逐漸恢復健康狀況,蟹體血清中ALT的恢復速度比AST快。

3.3中華絨螯蟹親蟹放流后血清蛋白的變化血藍蛋白是生物體內(nèi)的一種多功能蛋白,不僅具有輸氧、儲存能量、滲透壓調(diào)節(jié)、蛻皮過程調(diào)節(jié)、能量儲存、金屬離子轉(zhuǎn)運等功能[29,30],而且血藍蛋白還具有酚氧化酶活性,具有抗菌功能[31,32]。實驗發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹血清中血藍蛋白含量在放流后降低,9d后有所升高,13d降低并逐漸趨于穩(wěn)定。有研究表明,在較高鹽度的環(huán)境中血藍蛋白可以裂解為自由氨基酸來維持血淋巴滲透壓平衡[30],在實驗中中華絨螯蟹親蟹在放流后血藍蛋白含量降低應該是親蟹逐漸往咸淡水處洄游的結(jié)果。在10℃條件下,中華絨螯蟹親蟹進入咸水2—3d后便進入發(fā)情階段[33],血藍蛋白含量的升高可以滿足蟹體活動和交配時對耗氧量的需要[34],親蟹在放流后9d血藍蛋白含量升高,應該跟親蟹發(fā)情有關。ALB具有調(diào)節(jié)血漿膠體滲透壓以及運輸?shù)裙δ?。實驗發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹親蟹血清ALB含量在放流后出現(xiàn)升高,13d含量最高而后開始下降。初步認為中華絨螯蟹親蟹血清ALB含量在放流后升高是親蟹通過自身調(diào)節(jié)來減少應激反應的結(jié)果,一方面蟹體調(diào)節(jié)自身血漿膠體滲透壓,另一方面蟹體通過加速物質(zhì)的攝取和轉(zhuǎn)運來提高自身的代謝速度導致的。而放流70d后ALB含量顯著低于放流前水平,具體原因還有待進一步探討。血清TP不僅是一種重要的營養(yǎng)物質(zhì),還具有運輸、凝血、免疫以及調(diào)節(jié)血漿膠體滲透壓等作用[35],對蟹類的健康、營養(yǎng)、疾病的判斷具有重要意義。實驗發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹親蟹血清TP含量升高,而后逐漸下降并在22d后顯著低于放流前水平。王順昌等[34]研究表明,中華絨螯蟹血清中TP含量受鹽度刺激影響較大,在蟹體剛?cè)胂趟畷r有上升趨勢。在本實驗中親蟹在放流后TP含量升高,推測可能是親蟹往咸淡水洄游過程中受鹽度刺激的結(jié)果。親蟹血清TP含量在放流后13d下降并顯著低于放流前水平,可能是TP大量分解為自由氨基酸參與滲透壓調(diào)節(jié)的結(jié)果,也可能是受到血清中血藍蛋白和ALB含量降低的影響所致。

3.4中華絨螯蟹親蟹放流后血清肌酐與脂類的變化CREA是酸性肌酸的降解產(chǎn)物,在機體生理狀態(tài)正常時一般含量相對恒定,其含量的升高常被作為排泄器官受損和排泄功能受到破壞的判斷依據(jù)[36,37]。在甲殼動物中,主要的排泄器官為觸角腺和鰓[37]。本研究發(fā)現(xiàn)親蟹血清CREA含量在放流后6d升高,22d降低,到70d左右基本恢復至放流前水平,表明中華絨螯蟹親蟹放流后觸角腺或鰓可能受損,親蟹的排泄功能受阻,22d后親蟹受損器官和排泄功能逐步恢復至正常。血清中TC和TG含量能夠反映機體脂類代謝的變化。脂類是中華絨螯蟹標準狀況下最主要的能源物質(zhì)[38],脂類物質(zhì)含量的變化常被作為甲殼動物受到脅迫時的一種效應[39]。例如,對蝦在受到脅迫時主要通過脂肪代謝來滿足自身的能量需求[40,41]。實驗發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹親蟹血清TG含量在放流后呈現(xiàn)先降后升再降的波動變化,TC含量則呈先升后降的變化。分析認為親蟹血清中TG含量在放流后下降,可能是由于親蟹放流后通過脂肪分解獲取所需的能量來應對環(huán)境脅迫(主要是鹽度和溫度)的結(jié)果。有研究發(fā)現(xiàn),當機體通過脂類提供所需能量時,脂酶活性和機體內(nèi)游離脂肪酸含量升高,血液中TC含量降低[42,43]。在本實驗中親蟹在放流后通過分解脂肪獲取能量時,血清TC含量卻出現(xiàn)升高,具體原因還有待進一步研究。由于長江口環(huán)境的復雜性,本實驗選取回捕位置較集中的放流親蟹為實驗對象,而且受到回捕親蟹樣本量的限制,所得結(jié)果僅能初步反映長江口中華絨螯蟹放流親蟹對環(huán)境的生理適應狀況,而較大范圍全面的生理適應性還需要進行系統(tǒng)試驗進一步闡明。

4結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn),中華絨螯蟹親蟹在放流后向長江口咸淡水處洄游,蟹體出現(xiàn)非特異性免疫下降、代謝增強等反應,在放流后9d親蟹免疫力最低、物質(zhì)代謝均受到影響,放流后22d親蟹的各項機能逐步恢復,并均在70d接近或達到放流前水平,表明此時放流親蟹基本適應了長江口的環(huán)境,同時也表明放流親蟹對長江口環(huán)境的生理適應可能需要22d,這可為今后長江口中華絨螯蟹親蟹放流與生理適應評估提供理論參考。為提高增殖放流效果,建議在放流前對親蟹進行適宜的營養(yǎng)強化及環(huán)境適應性馴化。