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本文作者：李明堂劉夢(mèng)洋曹國(guó)軍趙蘭坡作者單位：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院

水土流失及溶質(zhì)遷移是耕地，尤其是坡耕地土壤質(zhì)量退化的主要原因之一，同時(shí)也是農(nóng)業(yè)面源污染及其導(dǎo)致的自然水體質(zhì)量惡化的重要因素。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在這方面的研究主要集中在不同耕作和降雨條件下農(nóng)田氮磷的流失機(jī)理、土壤－作物系統(tǒng)氮磷損失的定量評(píng)價(jià)和估算、氮磷流失對(duì)天然水體的影響等方面［1－4］。而關(guān)于受高氮磷含量農(nóng)田徑流污染水體的凈化研究相對(duì)不足。黑土是松遼平原玉米帶的主要土壤，由于長(zhǎng)期連作和化肥投入量逐年增多，導(dǎo)致土壤水土流失嚴(yán)重，尤其是大量的氮磷進(jìn)入封閉或半封閉水域后對(duì)水體富營(yíng)養(yǎng)化的貢獻(xiàn)日益突出，成為農(nóng)業(yè)面源污染急需解決的問題之一［5］。我國(guó)東北的黑土區(qū)低溫期長(zhǎng)，且無(wú)植被時(shí)風(fēng)蝕、雨水侵蝕和雪融水侵蝕導(dǎo)致大量的氮磷進(jìn)入水體中。由于無(wú)水生植物的吸收凈化作用，這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在水體中不斷積累，成為水華爆發(fā)的內(nèi)源污染負(fù)荷［6］。因此，減少非水華爆發(fā)期時(shí)水體中營(yíng)養(yǎng)鹽的內(nèi)源負(fù)荷對(duì)降低水體富營(yíng)養(yǎng)化水平將會(huì)產(chǎn)生積極意義。耐冷菌是指能在0～5℃生長(zhǎng)繁殖，最高溫度可達(dá)20℃以上的一類微生物，由于其具有抵抗環(huán)境變化的自我保護(hù)機(jī)制，所以在低溫環(huán)境中占據(jù)獨(dú)特的生態(tài)位并發(fā)揮重要作用［7］。研究表明，耐冷菌在低溫環(huán)境中可保持較高的生長(zhǎng)和代謝活性，能有效去除污水中的有機(jī)物和氮磷［8－9］。異養(yǎng)微生物在反硝化過程中不僅能從水體中脫除氮，而且會(huì)消耗大量的有機(jī)物，甚至?xí)ㄟ^反硝化聚磷作用明顯降低上覆水中磷酸鹽的濃度，因此在治理受污染水體和凈化水質(zhì)方面正引起人們的重視［10－12］。本文模擬研究了1株從富營(yíng)養(yǎng)化水體中分離得到的反硝化聚磷菌在不同條件下對(duì)農(nóng)田徑流污染水體中硝酸鹽氮和溶解性正磷酸鹽的去除特征，以期為受納農(nóng)田徑流的富營(yíng)養(yǎng)化水體的治理提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。

1材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)用接種液

所用菌株為課題組從低溫富營(yíng)養(yǎng)化水體中分離出的1株耐冷反硝化菌，16SrRNA序列分析表明該菌株屬不動(dòng)桿菌屬，與約氏不動(dòng)桿菌的親緣關(guān)系最近，將其命名為DBP－3，Genbank的登錄號(hào)為JN314436，保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（保藏號(hào)為CGMCC4753）。10℃時(shí)，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中菌株能在好氧和缺氧條件下以硝酸根或亞硝酸根為電子受體進(jìn)行反硝化作用，好氧時(shí)可過量吸收磷酸鹽聚集于細(xì)胞內(nèi)，厭氧時(shí)有明顯的釋放磷現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)前將保存于斜面的菌株挑取1環(huán)，接種于反硝化液體培養(yǎng)基中，在10℃和低溶解氧下靜置培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)于8000rpm下離心5min收集菌體，用無(wú)菌水洗滌菌體后，再懸浮于無(wú)菌水中，制成接種液（600nm處吸光度約為0．3），使用時(shí)接種量為1％（V／V）。液體培養(yǎng)基：NaAc1．0g，KH2PO40．1g，MgSO4•7H2O0．2g，NaCl0．2g，（NH4）2SO42．0g，CaCl2•2H2O0．025g，微量元素溶液1．0ml，蒸餾水1000ml，pH＝7．2。微量元素溶液：EDTA10．0g，ZnSO42．2g，CaCl25．5g，MnCl2•4H2O5．06g，F(xiàn)eSO4•7H2O5．0g，（NH4）6Mo7O2•4H2O1．1g，CuSO4•5H2O1．57g，CoCl2•6H2O1．61g，蒸餾水1000ml，pH＝7．2。

1．2農(nóng)田地表徑流的收集

選擇吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米試驗(yàn)田作為農(nóng)田地表徑流的收集場(chǎng)所。2010年5月于大雨的前1d布下農(nóng)田徑流收集裝置。在田間的低洼處挖1坑（60cm×60cm×60cm），放入5L的雨水收集器。在收集器頂部遮蓋以收集器為圓心，半徑為1m的圓形遮雨布，使得下雨期間，收集器周圍1m內(nèi)無(wú)降雨，以便流入收集器的地表徑流中能更多地溶解氮磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。收集器盛滿地表徑流后，將其取出拿回實(shí)驗(yàn)室，靜置10min，再用中速濾紙過濾，收集濾液與富營(yíng)養(yǎng)化水以1∶1的比例混合，作為實(shí)驗(yàn)用水，其中硝酸鹽氮濃度為5．78mg／L，溶解性正磷濃度為0．56mg／L。將水樣保存于－20℃冰箱中，所有實(shí)驗(yàn)在2個(gè)月內(nèi)完成。

1．3菌株好氧脫氮除磷實(shí)驗(yàn)

1．3．1培養(yǎng)條件和水樣預(yù)處理

向水樣中接種后，在10℃下振蕩培養(yǎng)（150rpm），同時(shí)設(shè)不接種的對(duì)照處理。定期采集水樣，過0．45μm濾膜抽濾后測(cè)定硝酸鹽氮和溶解性正磷酸鹽的濃度。

1．3．2菌株對(duì)水樣中氮磷的去除及其定殖能力

分別向原水樣和滅菌水樣（121℃高壓蒸汽滅菌）中接種并培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第2，4，6，8天采集水樣，進(jìn)行硝酸鹽氮和溶解性正磷酸鹽的測(cè)定。每天采集水樣并測(cè)定投加菌株的菌體細(xì)胞數(shù)量和細(xì)菌總數(shù)。

1．3．3其他條件對(duì)菌株脫氮除磷能力的影響

溫度：原水樣接種后分別在5，10，25℃下培養(yǎng)，5d后采樣測(cè)定氮磷濃度。鹽度：按照0％，1％，5％和10％的比例（m／V）向原水樣中分別添加氯化鈉，然后再加入接種液，10℃培養(yǎng)5d，采樣測(cè)定氮磷濃度。農(nóng)藥：分別將多菌靈和毒死蜱制成濃度為1000mg／L的儲(chǔ)備液，梯度稀釋后添加于原水樣中，2種農(nóng)藥的最終濃度都為0，20．0，40．0，60．0，80．0，100．0mg／L，接種后培養(yǎng)5d，測(cè)定氮磷的濃度。多菌靈的儲(chǔ)備液用稀鹽酸溶液和甲醇配制，毒死蜱的儲(chǔ)備液用氯仿配制。1．4分析測(cè)定方法硝酸鹽氮和溶解性正磷酸鹽分別采用酚二磺酸分光光度法和鉬銻抗分光光度法［13］測(cè)定。菌體細(xì)胞數(shù)量測(cè)定采用梯度稀釋平板計(jì)數(shù)法，培養(yǎng)基為加入1．8％瓊脂的反硝化液體培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基。每種處理3次重復(fù)，結(jié)果為各項(xiàng)指標(biāo)的平均值。

2結(jié)果與分析

2．1菌株對(duì)水樣中氮和磷去除的作用

將滅菌水樣＋菌和原水樣＋菌2種處理及只有滅菌水樣或原水樣的2種對(duì)照處理在10℃下避光培養(yǎng)，定期采集水樣并測(cè)定硝酸鹽氮和溶解性正磷酸鹽的濃度，以研究菌株的脫氮除磷能力，結(jié)果如圖1所示。從圖中可看出，整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，與未投加菌株的對(duì)照處理相比，投加菌株后培養(yǎng)體系中硝酸鹽氮和溶解性正磷酸鹽的去除率和去除速度明顯增加。菌株對(duì)滅菌水樣和原水樣中硝酸鹽氮的最終去除率分別為78．5％和70．2％，對(duì)溶解性正磷酸鹽的去除率分別為82．4％和74．6％，菌株對(duì)水樣中磷的去除能力稍大于對(duì)氮的去除能力。在未投加菌株情況下，原水樣培養(yǎng)一段時(shí)間后，硝酸鹽氮和溶解性正磷酸鹽的濃度仍有一定程度降低，而滅菌水樣中硝酸鹽氮和溶解性正磷酸鹽濃度變化不明顯?？梢酝茢?，低溫條件下投加的菌株對(duì)水樣中硝酸鹽氮和溶解性正磷酸鹽的去除起主要作用，菌株可通過反硝化作用和聚磷作用快速降低水中的氮和磷；同時(shí)原水樣中存在一些其他生物，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，這些生物不斷吸收或轉(zhuǎn)化水體中的硝酸鹽氮和溶解性正磷酸鹽，對(duì)水樣中氮和磷的去除也起到一定的作用。但由于低溫條件下，其他生物的代謝活動(dòng)緩慢，因此實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)對(duì)照處理中營(yíng)養(yǎng)鹽的去除效果不明顯。以上結(jié)果說明，菌株在強(qiáng)化修復(fù)低溫富氮磷水體方面具有一定的應(yīng)用潛力，但須采取一些其他措施進(jìn)一步提高菌株的脫氮處理能力，如菌株的固定化等。

2．2菌株在原水樣中的定殖

向原水樣中接入菌種，在10℃下培養(yǎng)，定期采集水樣，通過平板計(jì)數(shù)法分析水樣中投加菌株的數(shù)量動(dòng)態(tài)變化及占水樣中細(xì)菌總數(shù)的百分比，結(jié)果如圖2所示。表明，菌株加入到水樣中后，在整個(gè)培養(yǎng)期間內(nèi)數(shù)量上呈現(xiàn)緩慢上升和快速下降的過程，但在培養(yǎng)末期數(shù)量仍然可達(dá)4×105CFU／ml。實(shí)驗(yàn)初期菌體細(xì)胞數(shù)量增加不明顯，但從第2天到第4天數(shù)量增加相對(duì)較快，說明菌株加入到水樣中后具有一定的生存優(yōu)勢(shì)。隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的逐漸消耗和其他低溫生物的競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致在培養(yǎng)后期菌株出現(xiàn)數(shù)量快速下降現(xiàn)象。整個(gè)培養(yǎng)過程中菌株占水樣中細(xì)菌總數(shù)的比例范圍為68．3％～89．1％，說明菌株在低溫微生物生態(tài)系統(tǒng)中可占據(jù)數(shù)量上的優(yōu)勢(shì)，在實(shí)際生物修復(fù)中可對(duì)自然環(huán)境產(chǎn)生較強(qiáng)的適應(yīng)能力，具有明顯的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。測(cè)定采用梯度稀釋平板計(jì)數(shù)法，培養(yǎng)基為加入1．8％瓊脂的反硝化液體培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基。每種處理3次重復(fù)，結(jié)果為各項(xiàng)指標(biāo)的平均值。

2結(jié)果與分析

2．1菌株對(duì)水樣中氮和磷去除的作用

將滅菌水樣＋菌和原水樣＋菌2種處理及只有滅菌水樣或原水樣的2種對(duì)照處理在10℃下避光培養(yǎng)，定期采集水樣并測(cè)定硝酸鹽氮和溶解性正磷酸鹽的濃度，以研究菌株的脫氮除磷能力，結(jié)果如圖1所示。從圖中可看出，整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，與未投加菌株的對(duì)照處理相比，投加菌株后培養(yǎng)體系中硝酸鹽氮和溶解性正磷酸鹽的去除率和去除速度明顯增加。菌株對(duì)滅菌水樣和原水樣中硝酸鹽氮的最終去除率分別為78．5％和70．2％，對(duì)溶解性正磷酸鹽的去除率分別為82．4％和74．6％，菌株對(duì)水樣中磷的去除能力稍大于對(duì)氮的去除能力。在未投加菌株情況下，原水樣培養(yǎng)一段時(shí)間后，硝酸鹽氮和溶解性正磷酸鹽的濃度仍有一定程度降低，而滅菌水樣中硝酸鹽氮和溶解性正磷酸鹽濃度變化不明顯?？梢酝茢啵蜏貤l件下投加的菌株對(duì)水樣中硝酸鹽氮和溶解性正磷酸鹽的去除起主要作用，菌株可通過反硝化作用和聚磷作用快速降低水中的氮和磷；同時(shí)原水樣中存在一些其他生物，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，這些生物不斷吸收或轉(zhuǎn)化水體中的硝酸鹽氮和溶解性正磷酸鹽，對(duì)水樣中氮和磷的去除也起到一定的作用。但由于低溫條件下，其他生物的代謝活動(dòng)緩慢，因此實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)對(duì)照處理中營(yíng)養(yǎng)鹽的去除效果不明顯。以上結(jié)果說明，菌株在強(qiáng)化修復(fù)低溫富氮磷水體方面具有一定的應(yīng)用潛力，但須采取一些其他措施進(jìn)一步提高菌株的脫氮處理能力，如菌株的固定化等。

2．2菌株在原水樣中的定殖

向原水樣中接入菌種，在10℃下培養(yǎng)，定期采集水樣，通過平板計(jì)數(shù)法分析水樣中投加菌株的數(shù)量動(dòng)態(tài)變化及占水樣中細(xì)菌總數(shù)的百分比，結(jié)果如圖2所示。表明，菌株加入到水樣中后，在整個(gè)培養(yǎng)期間內(nèi)數(shù)量上呈現(xiàn)緩慢上升和快速下降的過程，但在培養(yǎng)末期數(shù)量仍然可達(dá)4×105CFU／ml。實(shí)驗(yàn)初期菌體細(xì)胞數(shù)量增加不明顯，但從第2天到第4天數(shù)量增加相對(duì)較快，說明菌株加入到水樣中后具有一定的生存優(yōu)勢(shì)。隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的逐漸消耗和其他低溫生物的競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致在培養(yǎng)后期菌株出現(xiàn)數(shù)量快速下降現(xiàn)象。整個(gè)培養(yǎng)過程中菌株占水樣中細(xì)菌總數(shù)的比例范圍為68．3％～89．1％，說明菌株在低溫微生物生態(tài)系統(tǒng)中可占據(jù)數(shù)量上的優(yōu)勢(shì)，在實(shí)際生物修復(fù)中可對(duì)自然環(huán)境產(chǎn)生較強(qiáng)的適應(yīng)能力，具有明顯的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。

2．3溫度對(duì)菌株脫氮除磷作用的影響

向原水樣和滅菌水樣中加入菌懸液，分別在5，10，25℃下培養(yǎng)5d后采集水樣，測(cè)定硝酸鹽氮和溶解性正磷酸鹽的濃度，分析不同培養(yǎng)溫度下菌株對(duì)水樣中氮磷的去除，同時(shí)設(shè)不加菌的對(duì)照處理（圖3）。結(jié)果表明，隨著溫度升高，模擬系統(tǒng)中氮磷的去除率逐漸增加。但5℃時(shí)菌株仍保持活力，原水樣和滅菌水樣中硝酸鹽氮的去除率分別為26．7％和29．4％，溶解性正磷酸鹽的去除率分別為37．4％和23．5％，與未投菌的對(duì)照處理相比差異顯著；25℃時(shí)，投菌的原水樣和滅菌水樣中硝酸鹽氮的去除率分別為76．3％和69．2％，溶解性正磷酸鹽的去除率分別為83．6％和72．5％。可以推斷低溫條件下（5℃和10℃）水樣中去除的氮磷主要是投加菌株的作用，水中的其他生物活性很低，對(duì)氮磷去除的貢獻(xiàn)及其與投加菌株的競(jìng)爭(zhēng)能力可忽略。隨著溫度升高，其他生物的活性開始恢復(fù)，對(duì)水樣中氮磷的去除有一定的貢獻(xiàn)，而投加菌株的生態(tài)優(yōu)勢(shì)逐漸失去。

2．4鹽度對(duì)菌株脫氮除磷作用的影響

分別按照質(zhì)量體積比為0％，1％，5％和10％的比例向水樣中加入氯化鈉，研究鹽度對(duì)水樣中菌株脫氮除磷能力的影響，結(jié)果如圖4所示。從圖中可看出，氯化鈉濃度為1％時(shí)，菌株對(duì)培養(yǎng)體系中氮磷的去除能力未受到任何影響，當(dāng)鹽濃度達(dá)5％時(shí)，培養(yǎng)體系中氮磷的去除率開始有所下降。當(dāng)鹽度達(dá)10％時(shí)，菌株的脫氮除磷能力受到明顯抑制。天然水體的鹽度會(huì)因融雪劑的使用、河流徑污比的降低和污水處理廠出水的排放等原因而增加，從而對(duì)微生物的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)產(chǎn)生影響［14］。研究表明，菌株DBP－3對(duì)鹽度具有一定的耐受性，當(dāng)氯化鈉濃度達(dá)10％時(shí)菌株的除磷能力才受到顯著影響，因此該菌株對(duì)水體中鹽濃度沖擊的忍受能力可能較強(qiáng)，應(yīng)用價(jià)值高。

2．5農(nóng)藥對(duì)菌株脫氮除磷作用的影響

多菌靈和毒死蜱2種農(nóng)藥對(duì)菌株脫氮除磷能力的影響特征如圖5所示。從圖中可看出，低濃度的多菌靈對(duì)菌株的脫氮除磷能力無(wú)明顯不利影響，甚至具有一定的促進(jìn)作用，但隨濃度增加，對(duì)菌株生長(zhǎng)代謝作用的影響越來(lái)越明顯，當(dāng)濃度達(dá)到60．0mg／L時(shí)，菌株的脫氮除磷能力開始受到不利影響，達(dá)到100．0mg／L時(shí)，菌株基本失去對(duì)氮磷的去除能力，從培養(yǎng)體系的濁度變化可看出，菌株的生長(zhǎng)被完全抑制。與多菌靈相比，當(dāng)毒死蜱濃度為40．0mg／L時(shí)，菌株的脫氮除磷能力就開始受到影響，隨著毒死蜱濃度增大，菌株的脫氮除磷能力逐漸減低；當(dāng)毒死蜱濃度增大到80．0mg／L時(shí)，菌株的脫氮除磷能力受到極強(qiáng)的抑制。通過以上分析可看出，菌株對(duì)多菌靈和毒死蜱具有一定的抗性，只有在較高濃度時(shí)多菌靈和毒死蜱才對(duì)對(duì)菌株的氮磷去除能力產(chǎn)生明顯的抑制，因此在實(shí)際應(yīng)用中基本不會(huì)產(chǎn)生影響，但值得注意的是，毒死蜱對(duì)菌株的毒性作用大于多菌靈。

3結(jié)論與討論

（1）農(nóng)業(yè)面源污染不僅使得土壤質(zhì)量因大量氮和磷的流失而日益下降，而且這些營(yíng)養(yǎng)鹽會(huì)通過各種途徑進(jìn)入天然水體中，加速了水體的富營(yíng)養(yǎng)化進(jìn)程，對(duì)飲用水安全和生態(tài)系統(tǒng)健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，成為急需解決的問題之一。我國(guó)北方，尤其是東北地區(qū)低溫期時(shí)，地表無(wú)植被覆蓋，風(fēng)、雨水和雪水沖刷極易導(dǎo)致土壤中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流失，但由于水體中無(wú)水華現(xiàn)象，因此水體中營(yíng)養(yǎng)鹽的積累問題往往容易被人們忽視。低溫菌和耐冷菌由于具有較強(qiáng)的低溫適應(yīng)能力，在水環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)鹽的去除方面正引起人們的重視。本文研究了通過低溫定向馴化技術(shù)從富營(yíng)養(yǎng)化水體中分離出的1株土著耐冷菌對(duì)農(nóng)田徑流污染水體中硝酸鹽和溶解性正磷酸鹽的去除特性。結(jié)果表明，該菌株在模擬系統(tǒng)中具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，能夠明顯去除導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)因子，對(duì)常見的水體環(huán)境因子鹽度和農(nóng)藥具有一定的抗性，具有廣闊的應(yīng)用前景。（2）實(shí)際應(yīng)用過程中由于多種環(huán)境因子同時(shí)起作用，以及其他生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)，單一菌株的生態(tài)優(yōu)勢(shì)往往容易發(fā)生變化。因此，下一步應(yīng)從菌群的角度進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同微生物間的功能關(guān)系，從而在實(shí)際應(yīng)用過程中讓優(yōu)勢(shì)菌處于適宜的生態(tài)幅內(nèi)，使其發(fā)揮最大的脫氮除磷能力。同時(shí)，由于聚磷作用主要發(fā)生在氧氣相對(duì)充足的情況下，因此可通過微生物固定化作用，讓其處于高溶解氧環(huán)境，以便保持高效的氮磷代謝能力。