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1激光共焦掃描顯微鏡

在使用普通光學(xué)顯微鏡時(shí),由于光的衍射極限造成的分辨率的限制與在高分辨率時(shí)顯微鏡的聚焦深度很小之間的矛盾一直沒有解決。自激光發(fā)明以來,激光在顯微鏡中的應(yīng)用日益廣泛,如利用激光的相干性成功的研制了全息顯微鏡,利用激光的單色性作為熒光激勵(lì)源設(shè)計(jì)成功的激光熒光顯微鏡等等。近十年來,隨著激光掃描測量圖像技術(shù)的發(fā)展,將其應(yīng)用于顯微領(lǐng)域從而形成了一種新型的顯微鏡———激光共焦掃描顯微鏡(LaserConfocalScanningMicroscope,簡稱LC-SM),給傳統(tǒng)的顯微鏡領(lǐng)域帶來了革新〔1,2〕。

2LCSM系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)

LCSM系統(tǒng)由激光光源、掃描頭、顯微鏡和圖像處理系統(tǒng)四個(gè)基本組成部分組成。

2.1激光光源目前可供LCSM系統(tǒng)選做激光光源的激光器有三種:(1)Ar+激光器。用空氣進(jìn)行制冷;功率為25mW;能夠輸出波長為488nm和514nm的兩條譜線;每條譜線功率為10mW。(2)Kr+/Ar+型混合氣體激光器。功率為15mW;可供選擇使用的有波長為488nm(約5mW)、488nm/568nm(約5mW)和647nm(小于5mW)的譜線。(3)Ar+(25mW)和He/Ne(0.3mW)雙激光系統(tǒng)。能夠輸出的譜線的波長為488nm、514nm和543nm。本實(shí)驗(yàn)室的LCSM系統(tǒng)是美國Bio-Rad公司產(chǎn)MRC-600型共焦掃描顯微鏡,所使用的激光器是Ar+激光器。

2.2掃描頭

掃描頭是系統(tǒng)最關(guān)鍵的組成部分。此裝置為雙通道:有兩個(gè)光電倍增管(PMT1、PMT2)可同時(shí)用來接收光信號,能夠?qū)ν挥^測物所發(fā)出的兩種光信號進(jìn)行同時(shí)觀察,大大提高了效率并能進(jìn)行實(shí)時(shí)對比。在使用通道1時(shí),調(diào)節(jié)MIRROR1和MIRROR4,使照射到樣品上的激光能夠?qū)崿F(xiàn)良好的聚焦,在使用通道2時(shí),調(diào)節(jié)MIRROR5可實(shí)現(xiàn)同樣的目的。IRIS2和IRIS2是兩個(gè)可變光闌,能夠限制進(jìn)入光電倍增管的光信號的量,并能濾除雜散光,提高成像質(zhì)量。FILTERSET1和FILTERSET2是兩組濾光片,使用不同的濾光片得到所需要的不同波段的光。

2.3顯微鏡

一般情況下,LCSM選用熒光顯微鏡,可獲得三種光信息:(1)反射光(或散射光)信息:激光聚焦的小亮點(diǎn)照射在樣品表面,在樣品表面發(fā)生反射和散射,反射光(或散射光)經(jīng)過物鏡后,被安置在物鏡像方的光電檢測器(如光電倍增管)接收,再將所接收信號送到計(jì)算機(jī)處理,能夠得到光強(qiáng)度及二維、三維圖像等信息。(2)透射光信息:將透過樣品的光用聚光鏡聚焦或用光纖收集后,經(jīng)過與(1)相同的處理過程,可以獲得所需透射信息。(3)熒光信息:有些樣品在激光照射后將產(chǎn)生熒光,熒光經(jīng)物鏡進(jìn)入光電檢測器得到熒光信息。探測這類光信息的顯微鏡稱為“激光熒光掃描顯微鏡”。

3LCSM系統(tǒng)的原理

LCSM采用共軛焦點(diǎn)技術(shù),使光源、被照物和探測器處在彼此對應(yīng)的共軛位置,光源通過系統(tǒng)在樣品上得到的會(huì)聚點(diǎn)與目鏡的焦點(diǎn)相重合,形成共焦。掃描是通過移動(dòng)樣品或移動(dòng)光點(diǎn)的方法實(shí)現(xiàn)的。LCSM的基本原理是:平行的激光束從物鏡的像方,向物鏡照射,并在樣品上由物鏡聚焦成一直徑很小的亮點(diǎn)。此亮點(diǎn)對樣品進(jìn)行二維掃描(可以是物面掃描,也可是像面掃描),將所獲二維信息輸入到計(jì)算機(jī)處理,從而獲得三維圖像信息。光源經(jīng)物鏡在樣品表面銳聚焦成衍射極限的斑點(diǎn),其反射光或透射光再次通過物鏡或聚光鏡在空間濾波器的共焦針孔平面成像。由靠近像面位置的探測器接受光信號。由于光照和探測都限制在樣品的一個(gè)點(diǎn),通過對視野內(nèi)所有的點(diǎn)逐個(gè)掃描即能獲得樣品的整個(gè)圖像。而在普通的光學(xué)顯微鏡中是把物體作為平面圖像進(jìn)行觀察的,容易產(chǎn)生不必要的散射光和閃爍引起的對比度降低。因而,與傳統(tǒng)的顯微鏡相比,LC-SM提高了成像的分辨率。

4LCSM的光學(xué)特性

4.1提高分辨率和圖像反差

先對LCSM的光學(xué)性能進(jìn)行分析。為分析方便,假定激光器為單模輸出,其徑向振幅分布為高斯函數(shù):E(u)=E0•exp(-U2/2σL2)(1)(E0為最大振幅,σL為此高斯函數(shù)的物征系數(shù))激光束一定要被聚焦到物平面上形成一個(gè)小亮點(diǎn),這個(gè)小亮點(diǎn)的振幅分布是(1)式的傅里葉變換:IL(X)=I0•exp(-2πσL2X2/λ2f02)(2)(λ為激光波長,f0為使激光束聚焦的等效系統(tǒng)的焦距。)再看顯微鏡成像光路,有兩種情況:第一種情況:由(2)式描述的激光聚焦小亮點(diǎn)的直徑6σLβ≥顯微鏡像面衍射圖形中心亮斑的直徑時(shí),此時(shí)的像面振幅分布函數(shù)I(X′)由兩部分組成:(1)顯微鏡產(chǎn)生的點(diǎn)像分布函數(shù)據(jù)為K(X′);(2)激光在物面聚焦的亮點(diǎn)的振幅分布函數(shù)(折到顯微鏡像面上為IL(X′)=I0•exp(-2πβ2σLX/2/λ2f02,β為顯微鏡的放大倍數(shù))。用卷積法把這兩部分合成為:→I(X′)=IL(X′)•K(X′)=I0exp(-2πβ2σL2X/2/λ2f02)∫K(ξ)exp(-2πiX′ξ/λS)dξ(3)(2a為顯微鏡光瞳直徑,ξ為坐標(biāo),K(ξ)為光瞳函數(shù))假設(shè)物鏡是理想的,則當(dāng)-a<ξ<a,K(ξ)=1當(dāng)ξ<-a<或ξ>a時(shí),K(ξ)=0于是,(3)式變?yōu)镮(X′)=I0exp(-2πβ2σL2X/2/λ2f02)∫-aK(ξ)×exp(-2πiX′ξ/λS)dξ(4)當(dāng)σL→0時(shí),即I(X′)→σ(X′),也就是說,使激光聚焦亮點(diǎn)直徑很小,根據(jù)卷積公式的基本性質(zhì),可得I(X′)→∫K(ξ)exp(-2πiX′ξ/λa)dξ(5)從上式可看出,其像面上的點(diǎn)像振幅分布函數(shù)也只是再現(xiàn)顯微物鏡的點(diǎn)像振幅分布,其分辨本領(lǐng)不會(huì)有所改善。第二種情況:由(2)式描述的激光聚焦小亮點(diǎn)的直徑6σLβ<顯微鏡像面衍射圖形中心亮斑的直徑時(shí),此時(shí)激光聚焦產(chǎn)生的小亮點(diǎn)不僅起到了前面描述的卷積作用,還起到了像面針孔作用,由它截取(3)式所描述的點(diǎn)像中心部分的振幅分布函數(shù)如下:當(dāng)X′<-3σLβ或X′>3σLβ時(shí),I(X′)=0當(dāng)-3σLβ<X′<3σLβ時(shí),I(X′)=I0exp(-2πβ2σL2X/2/λ2f02)∫-K(ξ)exp(-2πiX′ξ/λS)dξ(6)由(5)式可以得到以下有關(guān)分辨本領(lǐng)的結(jié)論:(1)LCSM的點(diǎn)像直徑基本上由激光聚焦的小亮點(diǎn)決定。傳統(tǒng)的顯微鏡在32×?xí)r,N.A.≈0.5,在λ=632•8nm,其彌散圓直徑≈0.5um。而激光聚焦光點(diǎn)直徑d=f•θ/Г,f為物方焦距,θ為激光發(fā)射角,Г為擴(kuò)束望遠(yuǎn)鏡倍數(shù),聚f=3mm,θ=3′4,Г=10X,則d=0.3um,即LCSM的分辨本領(lǐng)比傳統(tǒng)顯微鏡提高一倍左右,當(dāng)系統(tǒng)仔細(xì)設(shè)計(jì)時(shí),可望達(dá)成2~4倍。(2)LCSM點(diǎn)像能量分布既不是高斯函數(shù),也不是愛里衍射圖形,而是它們的卷積,這一卷積將使愛里衍射圖形平滑,即使提中心高斑之外的亮環(huán)亮度減弱甚至完全消除,這一作用將提高圖像的反差,有利于顯微鏡觀察生物體、細(xì)菌的細(xì)節(jié)甚至于內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

4.2獲得實(shí)時(shí)圖像

LCSM對樣品進(jìn)行二維掃描,有兩種形式:一是移動(dòng)樣品進(jìn)行掃描,但物面信息攝取速度太慢,得到一幅圖像要幾十秒到幾分鐘。二是移動(dòng)光點(diǎn)進(jìn)行掃描,其光束掃描采用電流反射鏡偏轉(zhuǎn)光束進(jìn)行掃描實(shí)現(xiàn)的。得到一幅圖像需幾秒到幾十秒。美國研制的利用聲光偏振器產(chǎn)生實(shí)時(shí)視頻圖像的LCSM〔3〕,1/30秒便可獲得一幅圖像〔4〕,大大提高了激光共焦掃描顯微鏡的性能,已無“掃描”的概念,似乎是“實(shí)時(shí)輸出”的顯微鏡了〔5〕。

4.3層析技術(shù)

LCSM把光束聚焦到樣品的某個(gè)層面,而把該層面前后的離焦光束掃掉,通過改變聚焦的深度便可獲得樣品的一個(gè)個(gè)層面的光學(xué)切片圖像,即層析技術(shù)。層析技術(shù)在激光掃描術(shù)中的早期應(yīng)用是研究半導(dǎo)體的局部特性,現(xiàn)在則應(yīng)用于激光共焦掃描顯微技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞或生物體的結(jié)構(gòu)分析,其主要信息來源是收集激光從細(xì)胞或生物體的表層進(jìn)入內(nèi)部所產(chǎn)生的散射光信息。如果對被觀察的生物樣品進(jìn)行了熒光著色,那么就可以收集到不同激光照射截面的熒光信息。它與電子顯微鏡相比,無需進(jìn)行超薄切片就可對活體進(jìn)行層析觀察,這正是生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究所十分希望實(shí)現(xiàn)的新技術(shù)。

5LCSM在生物、醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

利用LCSM在生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究工作,下文將從幾個(gè)方面對該類工作做簡要介紹。

5.1細(xì)胞Ca2+的研究

Ca2+做為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使,對它的研究是當(dāng)今生命科學(xué)研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。在LCSM出現(xiàn)之前,對Ca2+的研究大都是通過死細(xì)胞進(jìn)行的,所以無法對細(xì)胞內(nèi)的Ca2+信號進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察,而Ca2+信號的動(dòng)態(tài)變化是反映細(xì)胞生理過程及生理變化的重要信息。利用死細(xì)胞進(jìn)行研究,就無法對同一個(gè)細(xì)胞或同一組細(xì)胞的不同生長階段進(jìn)行觀察,缺乏對比性,也大大降低了可信度,并給研究工作帶來了困難。而LCSM技術(shù)從根本上解決了這個(gè)問題,利用LCSM觀察活細(xì)胞Ca2+動(dòng)態(tài)變化可以并且已經(jīng)獲得了大量信息。到目前為止,此項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞的研究居多。通過對單細(xì)胞Ca2+的研究發(fā)現(xiàn),Ca2+不僅在細(xì)胞局部區(qū)域間的分布是不均勻的,而且細(xì)胞內(nèi)各局部區(qū)域的不同深度或?qū)哟伍g也存在不同程度的Ca2+梯差即所謂空間Ca2+梯差〔6,7〕。細(xì)胞在受到外界刺激(如A23187、KCl、Ionomycin、Trition等)時(shí),Ca2+熒光信號強(qiáng)度會(huì)發(fā)生很大的變化〔6,7,16〕,隨著刺激時(shí)間的增長,即使刺激物繼續(xù)存在,細(xì)胞Ca2+熒光信號不但不會(huì)繼續(xù)增強(qiáng),反而會(huì)慢慢減弱,直至回復(fù)到未加刺激物時(shí)的水平。對于細(xì)胞受精過程中Ca2+熒光信號的變化情況,也已經(jīng)有人做過研究〔8〕。研究發(fā)現(xiàn),配子在粘著過程中,Ca2+熒光信號未發(fā)生任何變化,而配子之間發(fā)生熔合作用時(shí),Ca2+熒光信號強(qiáng)度卻會(huì)出現(xiàn)一個(gè)不穩(wěn)定的峰值,并可持續(xù)幾分鐘。這些現(xiàn)象,對研究受精引發(fā)的早期信號及Ca2+在卵細(xì)胞激活和受精卵的發(fā)育過程中的作用具有重要意義。在其它一些生理過程如細(xì)胞分裂、胞吐作用等,Ca2+熒光信號強(qiáng)度也會(huì)發(fā)生很顯著的變化。Ca2+是重要的第二信使,對于調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理反應(yīng)具有重要作用,開發(fā)和利用LCSM技術(shù)對Ca2+熒光信號進(jìn)行觀測,可以從某些方面對有機(jī)體或細(xì)胞的生理變化機(jī)制進(jìn)行分析、闡述,具有重要意義。

5.2細(xì)胞骨架的研究

細(xì)胞骨架在維持動(dòng)植物細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞分裂等生命活動(dòng)中有著重要的作用,細(xì)胞內(nèi)的骨架主要由微管和微絲組成,標(biāo)記有熒光染料的微管和微絲的特異性抗體(如FITC-Phall,TRITC-Phall,RHODA-Phall等)與微管和微絲結(jié)合后,利用LCSM可觀察到微管和微絲的具體形態(tài)。在細(xì)胞發(fā)生某些生理變化時(shí)(如外界刺激引起的內(nèi)皮細(xì)胞膜下Ca2+濃度升高),微管和(或)微絲的結(jié)構(gòu)及其位置也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化,利用LCSM不僅可以對其位置進(jìn)行定位,而且可以對其位置變化進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察,從而可進(jìn)一步探討微管和微絲在細(xì)胞生理中的作用機(jī)理〔10-14〕。

5.3病變細(xì)胞的研究

病變細(xì)胞與正常細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)以及在外界刺激下的細(xì)胞反應(yīng)是有差別的。如果能對某個(gè)生理過程進(jìn)行特異性熒光標(biāo)記,那么就可利用LCSM對其熒光信號進(jìn)行監(jiān)測,從而獲得病變細(xì)胞與正常細(xì)胞的不同信息,供進(jìn)一步研究。比如,使GFP(綠色熒光蛋白,GreenFluorescenceProtein)基因整合到病毒基因,利用LCSM實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的探測GFP發(fā)出的熒光,就可以判斷病毒侵染細(xì)胞的過程、侵染條件及抑制條件。這就極利于及早發(fā)現(xiàn)病變跡象,以獲得及時(shí)治療。

5.4藥物效用的研究

探討藥物在細(xì)胞水平上的作用部位、空間分布和作用時(shí)間,對提高藥效及研制新藥具有重要的積極作用。利用LCSM不僅可以對藥物在細(xì)胞中的分布及其所引起病變細(xì)胞的變化進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察〔15〕,而且還可以通過觀察在不同時(shí)間段內(nèi)藥物與其作用點(diǎn)(比如DNA)的結(jié)合情況,判斷服用藥物的最佳時(shí)間,這樣就可以進(jìn)一步提高藥效。另一方面利用LCSM還可以判斷新藥品的藥效。LCSM在藥物研究領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

6結(jié)束語

LCSM系統(tǒng)是一種集激光、顯微鏡和計(jì)算機(jī)于一體的新型、高精顯微鏡。LCSM具有的共焦成像分辨率高、能層析掃描無需制作繁瑣的電鏡切片以及能觀察樣品的三維圖像等優(yōu)點(diǎn),使其與生物技術(shù)相結(jié)合是生物、醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的一種強(qiáng)有力的儀器,有著廣闊的應(yīng)用前景。