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【關(guān)鍵詞】心肌/細(xì)胞學(xué)

Isolation,labellingandautotransplantationofleftauriclemyocytesinadultrabbit

【Abstract】AIM:Todevelopareliablemethodforisolationandfluorescentlabelingofadultrabbitleftauriclemyocytesandtoinvestigatethesurvivalofgraftedautologousleftauriclemyocytes.METHODS:TwentyadultNewZealandrabbitswererandomlyassignedtotransplantgroupandcontrolgroup(n=10).TheleftauricleofrabbitwasligatedandharvestedandtheauricularcellswereisolatedandlabeledwithDAPIexvivo.Eitheracellsuspension(transplantgroup)orculturemedium(controlgroup)wasinjectedintothenormalleftventricularanteriorwall.Therabbitsweresacrificedafter4weeksandspecimenswereharvestedandobservedbyhistologicmethods.RESULTS:Mostoftheisolatedcellswereobservedrodshaped.Themorphologicfeatureofthesecellscorrespondedtothatofauriclecardiomyocytesandthecellactivitywasgood.The“cellisland”couldbefoundinmyocardialinfarction(MI)areaoftransplantgroup,andthenucleiwithbluefluorescencecouldbefoundintransplantgroup,butnotincontrolgroup,whichconfirmedthesurvivalofimplantedcellsandthereliabilityofDAPIlabeling.Vasculardensityintransplantgroupwasbetterthanthatincontrolgroup(P=0.02).CONCLUSION:EnzymedigestionandDAPIlabelingarereliablemethodsfortheisolationandlabelingofleftauriclemyocytesinadultrabbits.IsolatedandDAPIlabeledauriclemyocytescansurviveafterautograftedintonormalventricularanteriorwallandmayimproveperipheralvascularproliferation.

【Keywords】myocardium/cytology;isolation;label;transplantation,autologous

【摘要】目的：建立可靠的成年兔心耳心肌細(xì)胞的急性分離和熒光標(biāo)記的方法，觀察心耳肌細(xì)胞移植到自體左室前壁的存活狀況.方法：成年新西蘭白兔20只，隨機(jī)分為移植組和對照組（n=10）.結(jié)扎并剪取自體左心耳組織，急性消化分離為單細(xì)胞，經(jīng)DAPI標(biāo)記后分別將細(xì)胞懸液和培養(yǎng)基注射到移植組和對照組自體正常左室前壁內(nèi).4wk后處死兔子，取移植區(qū)組織進(jìn)行組織學(xué)觀察.結(jié)果：急性分離的細(xì)胞中絕大部分為桿狀，形態(tài)結(jié)構(gòu)符合心耳肌細(xì)胞的特征，且細(xì)胞活性好.移植組梗死區(qū)內(nèi)可以觀察到“細(xì)胞島”狀結(jié)構(gòu)，行熒光檢測可見藍(lán)色熒光的細(xì)胞核，而對照組梗死區(qū)內(nèi)無細(xì)胞結(jié)構(gòu)，證明移植的心耳肌細(xì)胞在移植區(qū)存活以及DAPI標(biāo)記的可靠性.與對照組相比,移植區(qū)血管密度增高（P=0.027）.結(jié)論：酶消化法和DAPI熒光標(biāo)記是一套可靠的心耳肌細(xì)胞急性分離和標(biāo)記方法；急性分離的心耳肌細(xì)胞移植到自體左室前壁后可以存活，并能夠促進(jìn)周圍血管生長.

【關(guān)鍵詞】心肌/細(xì)胞學(xué)；分離；標(biāo)記；移植，自體

0引言

目前正在研究的心肌細(xì)胞移植技術(shù)是通過向已梗死的心肌組織內(nèi)移入新的細(xì)胞，以改善心臟功能［1］.本文旨在建立一套可靠的成年兔心耳肌細(xì)胞的分離標(biāo)記方法，并對其移植到自體心肌組織進(jìn)行研究,為進(jìn)一步應(yīng)用心耳肌細(xì)胞移植治療缺血性心臟病提供實驗基礎(chǔ).

1材料和方法

1.1材料

成年健康新西蘭白兔20只,雌雄不限,體質(zhì)量2.0~2.5kg,購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心.將實驗動物隨機(jī)分為移植組和對照組（n=10）.小牛血清(Gibco),DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司),胰蛋白酶(Gibco公司),膠原酶Ⅱ型（Sigma公司）,4,6二脒基2苯茚二酮(Sigma公司).

1.2方法

1.2.1自體左心耳心肌組織的取材取成年兔經(jīng)耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉（30mg/kg），左側(cè)胸骨旁切口，切斷第4肋骨進(jìn)胸，向上推開胸腺，剪開心包，顯露并牽引左心耳，用4號絲線結(jié)扎左心耳基底部后，剪取左心耳并立即置于預(yù)冷（4℃）的普通臺式液中.用鹽水紗布覆蓋傷口.

1.2.2左心耳心肌細(xì)胞的消化分離參照文獻(xiàn)［2］，在無鈣臺式液(mol/L:NaCl140,KCl5.4,MgCl21,酶糖10,HEPES5,pH7.4)中洗去血凝塊，用眼科剪將心耳組織剪碎，移入含有1.25g/L胰酶、0.25g/L膠原酶的無鈣臺式液中，37℃消化10min.輕柔吹打，自然沉淀后棄上清.再加入酶消化10min，輕柔吹打后，吸取上清，移入等體積含100mL/L新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液中.重復(fù)消化剩余組織2～3次，直至基本不可見有形組織.將收集的細(xì)胞懸液1000r/min,離心5min,棄上清，調(diào)整細(xì)胞密度為2×109/L.

1.2.3分離細(xì)胞的活性鑒定參考文獻(xiàn)［3］將40g/L的臺盼藍(lán)溶液與細(xì)胞懸液按照1：9混勻，進(jìn)行染色,3min后用紅細(xì)胞計數(shù)板分別計數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞,計算活細(xì)胞率［3］.

1.2.4分離細(xì)胞的標(biāo)記參照文獻(xiàn)［4］加入0.2g/L的4,6脒基2茚二酮(DAPI)于孵箱內(nèi)（37℃）熒光標(biāo)記細(xì)胞2h,使用錫箔包裹.用普通臺式液(mol/L:NaCl140,KCl5.4,CaCl21.8,MgCl21,glucose10,HEPES5,pH7.4)漂洗以去除未結(jié)合的DAPI.離心后收集細(xì)胞，加入無血清DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞密度為2×109/L的細(xì)胞懸液,以備細(xì)胞移植.

1.2.5分離細(xì)胞的觀察心肌細(xì)胞移植術(shù)前,動態(tài)觀察分離的心肌細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察用DAPI標(biāo)記好的心肌細(xì)胞.

1.2.6心肌細(xì)胞移植在左室前壁縫50滌綸線以作標(biāo)記，移植組將心肌細(xì)胞懸液經(jīng)特制的微量注射器注入左室前壁縫線標(biāo)記上方0.5cm處，對照組以相同量的DMEM培養(yǎng)液注射.逐層關(guān)胸,傷口局部應(yīng)用抗生素,手術(shù)中未發(fā)生氣胸及惡性心律失常.

1.2.7結(jié)果觀察4wk后用過量麻醉劑處死動物,取左室前壁縫線標(biāo)記點(diǎn)上方心肌組織，40g/L甲醛固定48h,行常規(guī)HE染色，使用熒光顯微鏡觀察并拍照.觀察移植區(qū)內(nèi)組織結(jié)構(gòu)及血管密度.同時,對移植部位石蠟切片(移植組及對照組動物取樣2個/只,共取樣本40個)，用第Ⅷ因子免疫組織化學(xué)染色移植區(qū)內(nèi)血管,光學(xué)顯微鏡200倍視野下血管計數(shù),統(tǒng)計移植區(qū)血管密度.

統(tǒng)計學(xué)處理：結(jié)果以x±s表示，采用SPSS11.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,組間比較用t檢驗.

2結(jié)果

2.1分離細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察及細(xì)胞活性對用酶消化法分離獲得的成年兔左心耳心肌細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,倒置顯微鏡下可見細(xì)胞大部分呈桿狀，邊緣清楚，胞質(zhì)豐富(Fig1),DAPI標(biāo)記2h后可見細(xì)胞核大,多為單核或多核.經(jīng)臺盼藍(lán)染色,死細(xì)胞染成淡藍(lán)色,活細(xì)胞拒染，計算活細(xì)胞率為95%.

2.2移植細(xì)胞在移植部位的存活情況細(xì)胞移植后4wk，對移植部位心肌組織切片進(jìn)行HE染色后觀察，光鏡下可見移植部位心肌組織內(nèi)心肌纖維排列整齊，方向基本一致，在移植細(xì)胞周圍沒有觀察到淋巴細(xì)胞浸潤.在相差熒光顯微鏡下可以觀察到移植組標(biāo)本中帶有藍(lán)色熒光的細(xì)胞核，證實移植的心耳肌細(xì)胞在移植部位存活.

2.3血管增生對移植部位石蠟切片，用第Ⅷ因子行免疫組織化學(xué)染色,光學(xué)顯微鏡200倍視野下觀察血管計數(shù),移植區(qū)血管密度(6.7±2.1)，高于對照組(3.6±1.2,P=0.027)，提示將自體心耳肌細(xì)胞移植到左室前壁后可以促進(jìn)周圍血管增生.

3討論

本實驗中,我們選用左心耳作為細(xì)胞來源，取材簡便，取材后對心功能影響不明顯.考慮到成年心肌細(xì)胞不能繼續(xù)分裂，故未進(jìn)行體外培養(yǎng)，而是選擇分離標(biāo)記后進(jìn)行細(xì)胞移植.在酶消化的過程中，除了按預(yù)定的時間進(jìn)行消化外，還應(yīng)根據(jù)肉眼觀察心耳肌組織碎塊的絮狀變化的程度，來決定中止酶消化的時機(jī).無鈣環(huán)境和酶消化時間過長將會損害細(xì)胞膜，并導(dǎo)致“鈣反?！保辜?xì)胞功能受損.

我們將分離的兔自體心耳肌細(xì)胞移植到正常左室前壁后,4wk后熒光檢測可以發(fā)現(xiàn)心肌標(biāo)本中帶藍(lán)色熒光的細(xì)胞核,說明移植的心肌細(xì)胞在梗死區(qū)內(nèi)存活，同時可以觀察到有血管形成，提示移植的心耳肌細(xì)胞可能分泌一些細(xì)胞因子如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、胰島素樣生長因子(IGF)［5,6］等，促進(jìn)移植區(qū)內(nèi)血管的增生，以適應(yīng)性加強(qiáng)局部血液供應(yīng).我們在移植細(xì)胞周圍沒有觀察到大量淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤，說明自體心肌細(xì)胞移植不會產(chǎn)生免疫排斥相關(guān)的炎性反應(yīng).通過本實驗對自體心肌細(xì)胞移植的可行性研究，為下一步研究自體心肌細(xì)胞移植到梗死區(qū)心肌以治療缺血性心肌病提供了實驗基礎(chǔ).

【參考文獻(xiàn)】

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