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1材料與方法

1．1利用江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所十字花科項(xiàng)目組不結(jié)球白菜研究材料T青做父本進(jìn)行轉(zhuǎn)育，得到F1代。2011年春，將雙親及F1代種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所實(shí)驗(yàn)田。對(duì)F1代植株進(jìn)行自交，得到F2代，F(xiàn)1代單株與不結(jié)球白菜親本回交，得到BC1代。田間管理按常規(guī)方法進(jìn)行。

1．2方法

1．2．1各世代植株抗性鑒定供試材料:T青、結(jié)球白菜抗源CR、F1、F2及BC1。每個(gè)材料3次重復(fù)，每次重復(fù)30株，隨機(jī)排列，播種于50孔穴盤(pán)。待苗長(zhǎng)到3～4片真葉時(shí)移栽營(yíng)養(yǎng)缽，采用灌根法進(jìn)行抗性鑒定。用移液器吸取1ml含5×107或1×108個(gè)孢子懸浮液10ml，澆注到寄主根際周?chē)泳?周后，洗凈根部泥土，調(diào)查單株發(fā)病情況，并計(jì)算病情指數(shù)。田間病情分級(jí)參考前人研究分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［3］，略有改動(dòng)。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為:0級(jí)，未發(fā)生病害;1級(jí)，根系的須根、側(cè)根有較少細(xì)小腫瘤，主根未發(fā)生病害;2級(jí)，根系的須根腫瘤多，側(cè)根腫瘤較多，主根發(fā)病較輕，微微腫大;3級(jí)，根系的主根發(fā)病較重，異常腫大，大部分須根、側(cè)根腫瘤多;4級(jí)，根系的主根異常腫大，根系幾乎無(wú)須根。0級(jí)為抗病，其他均為感病。

1．2．2抗感池的構(gòu)建及引物篩選采用BSA法，在F2群體中分別隨機(jī)選取10株抗病單株和10株感病單株，將其DNA等量混合，構(gòu)建抗病基因池和感病基因池，對(duì)引物進(jìn)行篩選，挑選在抗、感病池間能夠產(chǎn)生特異性條帶的引物。

1．2．3PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序ISSR反應(yīng)體系的總體積為20μl，包括1×PCRbuffer，模板DNA30ng，Taq酶1U、dNTP250.00μmol/L、引物0.25μmol/L、Mg2+2.5mmol/L。ISSR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min;94℃變性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min30s，循環(huán)35次;72℃延伸10min，擴(kuò)增產(chǎn)物4℃保存。

1．2．4瓊脂糖電泳分離反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物點(diǎn)入含0.5μg/mlEB的2.0%瓊脂糖凝膠中，以DNAmarkerV(Tiangen)作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，在2．0%瓊脂糖凝膠中電泳1h，紫外凝膠成像儀下照相。

1．2．5ISSR標(biāo)記的連鎖分析將篩選出的ISSR標(biāo)記在雙親及F2分離群體中進(jìn)行驗(yàn)證，用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。親本為抗病有標(biāo)記帶和感病無(wú)標(biāo)記帶，F(xiàn)1代為感病有標(biāo)記帶，F(xiàn)2代中重組型個(gè)體為抗病無(wú)標(biāo)記帶、雜合感病無(wú)標(biāo)記帶和純合感病有標(biāo)記帶，根據(jù)F2代中重組型單株的數(shù)量計(jì)算交換率，再根據(jù)Kosambi作圖函數(shù)公式換算成Morgan遺傳距離。

2結(jié)果

2．1抗根腫病群體抗性鑒定親本、F1、F2和BC1群體對(duì)根腫病的抗性鑒定結(jié)果(表1)顯示，結(jié)球白菜抗源CR共接種20株，表現(xiàn)為高抗根腫病(抗性等級(jí)為0級(jí))，T青共接種20株，表現(xiàn)為高感根腫病(抗性等級(jí)為3級(jí)以上)。F1共接種30株，表現(xiàn)為高抗根腫病(抗性等級(jí)為0級(jí))。F2隨機(jī)選取73株，54株表現(xiàn)為高抗(抗性等級(jí)為0級(jí))，其他感病(1株病級(jí)為1級(jí)，2株病級(jí)為2級(jí)，16株病級(jí)達(dá)3級(jí))，抗感分離比為54∶19，滿(mǎn)足3∶1(χ2=0.074＜χ20．05=3.84)。BC1隨機(jī)選取70株，36株表現(xiàn)為高抗(抗性等級(jí)為0級(jí))，34株感病(2株病級(jí)1級(jí)，1株病級(jí)2級(jí)，31株病級(jí)達(dá)3級(jí))，抗感分離比為36∶34，滿(mǎn)足1∶1(χ2=0.057＜χ20．05=3.84)。分析各病級(jí)范圍內(nèi)的單株頻數(shù)，未發(fā)現(xiàn)4級(jí)病害的單株。表明該根腫病的抗性受顯性單基因控制。

2．2分子標(biāo)記的篩選用90條ISSR引物進(jìn)行親本PCR擴(kuò)增，其中21條ISSR引物可以在親本間穩(wěn)定擴(kuò)增出清晰多態(tài)性條帶，占總引物數(shù)的23.0%。將能夠擴(kuò)增到清晰多態(tài)性條帶的引物在抗感池中篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，引物873(5''''-GA-CAGACAGACAGACA-3'''')可以在抗感基因池中擴(kuò)增出多態(tài)性條帶，差異片段分別約為500bp(圖1)。由于抗根腫病基因是顯性基因，如果標(biāo)記與抗病基因緊密連鎖，純合抗病株和雜合抗病株都能擴(kuò)增出此帶，而純合感病株應(yīng)沒(méi)有此帶。利用F2分離群體中的73個(gè)單株DNA對(duì)候選引物進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果顯示，標(biāo)記873在54份高抗根腫病單株(抗性0級(jí))中，53個(gè)擴(kuò)增出差異條帶，1個(gè)未擴(kuò)增出差異條帶。同樣19份感病單株中，有6份擴(kuò)增產(chǎn)生特異條帶。因此共有7株在標(biāo)記873與抗病基因之間發(fā)生重組，交換率為9．59%。依據(jù)Kogambi圖函數(shù)公式得出標(biāo)記873與抗根腫病基因之間的遺傳距離為9．72cM，命名為CR-873。

3討論

在B．rapa中發(fā)現(xiàn)了至少3個(gè)主要的根腫病抗性基因，這些基因是相對(duì)獨(dú)立的，且分別對(duì)不同的P．brassicae生理小種發(fā)生作用［12-14］。Diederichsen等利用ECD04和DH群體發(fā)現(xiàn)了B．napus根腫病抗性由1個(gè)主效基因和至少2個(gè)隱性基因控制［15］。王芳展等認(rèn)為，B．rapa大多數(shù)抗性基因都來(lái)自于歐洲飼料蕪菁，不同的品種獲得了1個(gè)或者多個(gè)的抗性基因，而這些基因之間又相對(duì)保持獨(dú)立［16］。本研究通過(guò)對(duì)抗根腫病多世代群體進(jìn)行抗性鑒定表明，不結(jié)球白菜抗性由顯性單基因控制。Matsumoto等發(fā)現(xiàn)了2個(gè)RFLP標(biāo)記與1個(gè)CR基因CRa連鎖，并將其定位在R3染色體34cM的位置上［17］。Suwabe等利用SSR標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)了Crr1和Crr22個(gè)CR位點(diǎn)［18］。Kuginuki等利用Siloga作為抗源，發(fā)現(xiàn)了3個(gè)RAPD標(biāo)記與CR位點(diǎn)連鎖［19］。ISSR技術(shù)可以比RFLP、SSR、RAPD等技術(shù)更多地揭示基因組中的多態(tài)性，并比RAPD穩(wěn)定，比AFLP簡(jiǎn)便，是一種很好的DNA指紋標(biāo)記。本研究采用BSA和ISSR技術(shù)相結(jié)合來(lái)研究與不結(jié)球白菜抗根腫病基因連鎖的標(biāo)記，得到1個(gè)與根腫病抗性基因連鎖較緊密的分子標(biāo)記CR-873，遺傳距離為9.72cM。本研究中得到的CR-873標(biāo)記與抗根腫病基因的遺傳距離仍然較遠(yuǎn)，可能是因?yàn)楸狙芯恐杏糜谟?jì)算遺傳距離的群體偏小，一定程度上影響遺傳距離的準(zhǔn)確性。后續(xù)研究可以進(jìn)一步擴(kuò)大群體并把獲得的可能與抗根腫病基因相連鎖的ISSR標(biāo)記轉(zhuǎn)換為更穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記。

作者：張慧徐海況媛媛宋波陳龍正袁希漢單位：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院