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【摘要】目的觀察δ-連環(huán)素在大鼠糖尿病模型海馬神經(jīng)元中的表達特征。方法根據(jù)實驗需要將大鼠隨機分成糖尿病組、正常對照組和緩沖劑組。按45mg/kg一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素(溶于0.1mol/L檸檬酸鹽緩沖液)誘發(fā)糖尿病,緩沖劑組只給予等量的緩沖液。應用免疫組織化學方法觀察海馬神經(jīng)元的形態(tài)結構變化，并應用計算機圖像分析技術檢測δ-連環(huán)素在各組中的定量表達。結果糖尿病組大鼠海馬神經(jīng)元中δ-連環(huán)素表達明顯低于正常對照組和緩沖劑組，在海馬齒狀回減少尤為明顯。結論糖尿病可下調大鼠海馬神經(jīng)元中δ-連環(huán)素的表達。

【關鍵詞】δ-連環(huán)素;糖尿病;海馬;大鼠;免疫組織化學

糖尿病神經(jīng)病變是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥之一，可引起認知功能障礙及大腦的神經(jīng)生理和結構改變[1-2]。海馬是與腦高級功能相關的重要結構，在糖尿病患者中易受到損害，表現(xiàn)為更易發(fā)生中風、癡呆和認知減退[3]。

δ-連環(huán)素屬于P120-catenin蛋白家族，特異性地表達在神經(jīng)元[4]。研究發(fā)現(xiàn)δ-連環(huán)素過表達能誘導細胞形成樹突狀突起，并增加原代海馬細胞中樹突的形成[5]。已有報道δ-連環(huán)素基因變異小鼠表現(xiàn)出嚴重的學習障礙、突觸可塑性降低和突觸成分的改變。糖尿病患者認知功能減退的機制至今不明，在糖尿病動物海馬神經(jīng)元中δ-連環(huán)素的表達變化也鮮有報道。

1材料和方法

1.1動物分組及模型制備SD雄性大鼠，體重260～300g，徐州醫(yī)學院實驗動物中心提供。隨機分成正常對照組、緩沖劑組和糖尿病組(n=9)。按文獻[6]方法，一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素45mg/kg(溶于0.1mol/L檸檬酸鹽緩沖液),緩沖劑組只給予等量的緩沖液。3天后測血糖，血糖>16.7mmol/L,飲水及尿量明顯增多為造模成功。造模成功后常規(guī)飼養(yǎng)60天，中間不進行胰島素干預，也不進行糖尿病飲食控制，造模后每周監(jiān)測血糖。每組取9只大鼠5%茂巴比妥鈉腹腔注射麻醉，經(jīng)心臟先灌注100ml的生理鹽水后灌注4%多聚甲醛〔0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)，pH7.3配制〕固定30min。動物靜置于4℃冰箱3h后取大腦，用上述固定液后固定約6h(4℃)。并修取含海馬腦段，經(jīng)20%蔗糖-PBS液沉底后，-20℃恒冷切片機切片，片厚20μm。每個動物均依次等距離間隔選取切片,貼片。

1.2血糖測定造模3天和取材前內眥靜脈取血測血糖,血糖測定采用葡萄糖氧化酶法血糖試劑盒。

1.3SABC法免疫細胞化學反應切片經(jīng)：①300mg/LH2O220min;②4%牛血清白蛋白(4%BSA)封閉，37℃30min;③δ-連環(huán)素1∶200，4℃18h后，室溫孵育6h;④生物素標記IgG1∶300，室溫孵育2h;⑤SABC復合物1∶300，室溫孵育1h;⑥3mg/LH2O2和5mg/LDAB顯色，顯微鏡下觀察，出現(xiàn)陽性顆粒后終止反應。反應步驟③～⑥過程中，每步后均用0.01mol/LPBS，pH7.3漂洗3次，每次10min。切片經(jīng)乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片。

1.4海馬齒狀回DG區(qū)δ-連環(huán)素陽性反應產(chǎn)物吸光度測定分析每只動物各取進行過SABC反應的不相鄰切片6張(間隔20μm)。400倍的高倍鏡下，在海馬DG區(qū)隨機選取10個視野，采用Image-ProPlus5.1圖像分析系統(tǒng)對各組δ-連環(huán)素反應陽性的細胞進行吸光度的半定量分析。實驗數(shù)據(jù)用t檢驗進行統(tǒng)計處理。

1.5統(tǒng)計學方法所有結果用SPSS12.0分析。各組之間差異用單因素方差分析檢驗。再用Student-Newman-Keuls進行兩兩比較，結果用±s表示。P<0.05表示在統(tǒng)計學上有顯著性差異。

2結果

2.1大鼠海馬區(qū)δ-連環(huán)素的表達結果顯示δ-連環(huán)素免疫反應陽性產(chǎn)物呈棕黃色細顆粒狀，在海馬各亞區(qū)的神經(jīng)元胞質和胞膜中均有表達。顯微鏡下觀察到，正常對照組(圖1B，E)和緩沖劑組(圖1C、F)大鼠海馬神經(jīng)元中的δ-連環(huán)素免疫反應的陽性顆粒色深密集，均明顯高于糖尿病組(圖1A、1D)。在海馬齒狀回(DG區(qū))δ-連環(huán)素主要表達于顆粒層和顆粒下層，少量表達于門區(qū)。大鼠海馬齒狀回δ-連環(huán)素的表達在糖尿病組減少更加明顯。正常對照組和緩沖劑組間大鼠海馬神經(jīng)元中δ-連環(huán)素的免疫反應差異不明顯。

圖1δ-連環(huán)素catenin在各組大鼠海馬神經(jīng)元中表達

其中A(×40)和D(×400)為糖尿病組，B(×40)和E(×400)為正常對照組，C(×40)和F(×400)為緩沖劑組

2.2海馬齒狀回(DG)δ-連環(huán)素陽性反應產(chǎn)物吸光度測定分析正常組和緩沖劑組海馬神經(jīng)元中δ-連環(huán)素吸光度(absorbance)(A)無明顯差異，但分別高于糖尿病組304%和291%，其差別具有顯著性意義。見表1。表1各組大鼠海馬齒狀回神經(jīng)元中δ-連環(huán)素表達的定量分析結果3討論

本實驗發(fā)現(xiàn)δ-連環(huán)素在糖尿病組海馬神經(jīng)元中的表達低于正常對照組和緩沖劑組，提示大鼠糖尿病的神經(jīng)性損害對海馬神經(jīng)元δ-連環(huán)素的表達產(chǎn)生了下調作用。超級秘書網(wǎng)

文獻報道在糖尿病小鼠大腦中海馬神經(jīng)元的發(fā)生不足，數(shù)量降低。DG區(qū)海馬神經(jīng)元的發(fā)生可能與一定的記憶相關[7]。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)糖尿病組大鼠海馬各亞區(qū)神經(jīng)元變大腫脹，空泡樣變，胞膜破損，及δ-連環(huán)素在DG區(qū)表達明顯減少，表明δ-連環(huán)素表達的減少在糖尿病大鼠認知和學習記憶功能減退方面可能發(fā)揮一定作用。

δ-連環(huán)素參與鈣黏連蛋白-連環(huán)素復合體的構成，在突觸后膜與包括PSD95在內的PSD蛋白組分相互作用，并且在C末端包含1個PZD結合序列[8]。信號復合體(signalosome)是近年發(fā)現(xiàn)的激素對細胞進行調節(jié)的一種組合模式。已有文獻報道，雌激素與PSD95對神經(jīng)元突起和突觸的結構調控，正是通過信號復合體的模式進行的[9]，在這一過程中，雌激素與PSD95形成signalosome。當雌激素與PSD95形成signalosome后能夠對神經(jīng)元突起和樹突棘生長產(chǎn)生調控作用。推測由糖尿病胰島素降低而產(chǎn)生上述實驗結果的原因可能也是通過這種方式。另外在突觸后膜δ-連環(huán)素也可能通過PZD結構域在不同的亞細胞區(qū)域與其他的蛋白相互作用[8，10]，而胰島素的降低可能促進了δ-連環(huán)素與其他的蛋白的相互作用，從而改變突觸塑型，進而引起認知功能和學習記憶功能減退。關于δ-連環(huán)素在糖尿病神經(jīng)損傷過程中的分子生物學機制還需要進一步深入的研究。

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