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1NO的生物化學(xué)

NO是一種難溶于水、高脂溶性的小分子氣體,極易通過細(xì)胞膜擴(kuò)散。它擁有額外電子,化學(xué)反應(yīng)能力強(qiáng),生物學(xué)半衰期為3～5s。體內(nèi)NO是由NO合成酶(nitricoxidesynthase,NOS)催化L-精氨酸(L-Arg)轉(zhuǎn)變?yōu)長-瓜氨酸時產(chǎn)生的。NO在多種細(xì)胞中均能生成,生成后很快被氧化成NO2-和NO3-,從而失去生物學(xué)活性。NOS是NO反應(yīng)通路的限速酶,根據(jù)其來源及作用特點,可分為神經(jīng)元型(nNOS)、內(nèi)皮型(eNOS)和誘導(dǎo)型(iNOS)3種;根據(jù)其被提純順序及克隆結(jié)果,又可分為3種同工酶,即同工酶Ⅰ(nNOS)、同工酶Ⅱ(iNOS)、同工酶Ⅲ(eNOS)。nNOS與eNOS在體內(nèi)可連續(xù)表達(dá),通過Ca2+內(nèi)流及鈣調(diào)蛋白(CaM)激活,激活后產(chǎn)生短時效少量的NO;而iNOS則需要α-腫瘤壞死因子(TNF-α)、γ-干擾素(INF-γ)、白細(xì)胞介素1(IL-1)、細(xì)胞脂多糖(LPS)等誘導(dǎo)才表達(dá),產(chǎn)生局部高濃度的NO而介導(dǎo)后繼的長效反應(yīng)[1]。一般認(rèn)為,iNOS的激活不依賴于Ca2+/CaM,但目前3種NOS在Ca2+/CaM依賴性上的區(qū)別日趨模糊。

NOS的C端與細(xì)胞色素P-450還原酶有共同序列[2],具有顯著同源性。3種同工酶是不同的基因產(chǎn)物,種屬間NOS氨基酸序列具有高度保守性,人類各同工酶之間序列同源性為50%～60%,而不同種屬動物間相同同工酶序列同源性大于90%。目前3種同工酶的cDNA結(jié)構(gòu)已被克隆和表達(dá)。所表達(dá)的3類NOS的N端結(jié)構(gòu)極其相似,可能與其L-Arg結(jié)合位點和催化活性有關(guān)。利用特異性DNA探針已經(jīng)證明,人NOS3種同工酶基因分別位于12號、17號和7號染色體,它們的基因結(jié)構(gòu)已部分搞清,對基因中某些結(jié)構(gòu)區(qū)域的功能也有了一定了解。通過某些細(xì)胞因子、酶類、Ca2+/CaM及激素等調(diào)控因子對NOS基因表達(dá)影響的研究,闡明了mRNA穩(wěn)定性是NOS活性的重要調(diào)節(jié)點[3],而且NO能反饋抑制NOS的活性。NO的作用靶是鳥苷酸環(huán)化酶(GC)。NO與含血紅素的GC上Fe2+結(jié)合,激活后的GC導(dǎo)致cGMP水平增加,cGMP再作用于cGMP依賴的蛋白激酶及磷酸二酯酶,調(diào)節(jié)離子通道,使有關(guān)遞質(zhì)釋放而發(fā)揮生理效應(yīng)。NO激活的GC可使cGMP生成速度加快50～200倍。NO和GC的結(jié)合代表著一種新的廣泛存在的將細(xì)胞外信息轉(zhuǎn)導(dǎo)為鄰近細(xì)胞內(nèi)cGMP的信息傳遞機(jī)制。NO對腺苷二磷酸(ADP)核苷基轉(zhuǎn)移酶也有作用。此酶可將ADP的核苷基團(tuán)轉(zhuǎn)移至線粒體蛋白與線粒體中酶蛋白的羧基上,使蛋白構(gòu)象改變而發(fā)揮作用。影響NO生物作用的主要因素是NO的生物半衰期。另有報道,NO能降低細(xì)胞內(nèi)的游離Ca2+濃度,從而防止細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度過高,保護(hù)細(xì)胞;反過來,NO生成又依賴于細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+,Ca2+對維持NOS活性是必需的。

2NO對機(jī)體主要系統(tǒng)的作用

2.1NO對心腦血管系統(tǒng)的作用NO是血管平滑肌擴(kuò)張劑,可使血管舒張,血壓下降。正常情況下,血管內(nèi)皮細(xì)胞和心內(nèi)膜釋放少量的NO,維持適度的血流、血壓和腦血管屏障通透性。NO通過cGMP抑制血小板的凝集和粘附,發(fā)揮內(nèi)源性抗血栓作用。NO是血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要分子,異常的NO生物利用度與許多血管疾病有關(guān)[4]。在病理情況下,NO釋放減少,內(nèi)皮素增加,可導(dǎo)致血管舒縮功能調(diào)節(jié)失調(diào)、血小板凝聚和內(nèi)皮細(xì)胞增殖,引起一系列心血管疾病,如高血壓、血管痙攣、高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化性心臟病等。低濃度NO對充血性心衰、循環(huán)性休克、腦缺血、動脈粥樣硬化和高血壓等許多疾病有治療作用。臨床上應(yīng)用的硝普鈉(SNP)、硝酸甘油等NO供體藥物,都具有舒血管作用,同時還有更重要的細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)。NO供體保護(hù)心肌的主要機(jī)制是降低過氧化物酶活性,減少超氧自由基,進(jìn)而減少中性粒細(xì)胞粘附于內(nèi)皮和保護(hù)內(nèi)皮機(jī)能;另一方面,NO通過降低心肌對β-腎上腺素能刺激的反應(yīng)性而使耗氧量減少[5]。NO供體對腦、內(nèi)臟、腎等各種血管床缺血再灌及休克治療中的內(nèi)皮功能保護(hù)也有特殊作用。

2.2NO對神經(jīng)系統(tǒng)的作用NO是一種特殊的擴(kuò)散性神經(jīng)遞質(zhì),不貯存于突觸小泡內(nèi),既可作為突觸前遞質(zhì)從神經(jīng)末梢釋放;也可作為突觸后遞質(zhì),從突觸后膜釋放。在外周神經(jīng)系統(tǒng)中,NO作為突觸前遞質(zhì)從非腎上腺素能非膽堿能(NANC)神經(jīng)元末梢釋放。NO除直接作用外,還通過調(diào)節(jié)乙酰膽堿、兒茶酚胺、興奮性和抑制性氨基酸、5-羥色胺、組織胺等神經(jīng)遞質(zhì)間接發(fā)揮作用[6]。NO與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系密切。海馬中一些區(qū)域在重復(fù)刺激后可產(chǎn)生長時程突觸增強(qiáng)(LTP)效應(yīng),NO對維持LTP有重要作用。用SNP可使海馬突觸效應(yīng)持續(xù)增強(qiáng),而向海馬神經(jīng)元注射NOS抑制劑NG-硝基-L-精氨酸(L-NNA)和用Hb結(jié)合NO都可阻斷LTP。從NO入手將為尋找新型促智藥及防治早老性癡呆病(AD)提供新思路。NO與痛覺傳導(dǎo)密切相關(guān)。給與NOS抑制劑L-N-硝基精氨甲酯(L-NAME)后,小鼠在福爾馬林足底注射法、熱板法和乙酸導(dǎo)致的扭體模型上,均表現(xiàn)出明顯且持久的抗傷害作用。但無炎癥并發(fā)的急性和慢性疼痛似乎不依賴于NO[7]。

NO在嗅覺、視覺、觸覺的感應(yīng)傳導(dǎo)中也發(fā)揮作用。NO是陰莖勃起的主要遞質(zhì),能增強(qiáng)性功能。用NOS免疫組化技術(shù),發(fā)現(xiàn)NOS選擇性地分布于支配大鼠陰莖平滑肌的神經(jīng)元中。直接應(yīng)用NO和L-Arg會產(chǎn)生如神經(jīng)受刺激一樣的海綿體平滑肌松弛作用,而NOS抑制劑選擇性地抑制肌松弛。NO在中樞神經(jīng)系統(tǒng)及其對某些神經(jīng)遞質(zhì)釋放的調(diào)節(jié)中有雙重作用。eNOS可舒張血管和增加腦血流而具有神經(jīng)保護(hù)作用。nNOS活性增強(qiáng)可加劇神經(jīng)元損傷。過量釋放的NO可誘發(fā)癲癇,導(dǎo)致腦損傷和記憶缺損。例如,AD病人的大腦海馬中NOS陽性神經(jīng)元數(shù)明顯低于正常人。而帕金森氏綜合癥(PD)患者腦膠質(zhì)細(xì)胞中iNOS的表達(dá)與神經(jīng)元損傷相關(guān),其大量生成的NO加劇了多巴胺(DA)神經(jīng)傳導(dǎo)障礙。軍用神經(jīng)毒毒劑梭曼對小鼠的毒性可被Arg增強(qiáng),被L-NAME減弱,且有劑量反應(yīng)關(guān)系,而且梭曼中毒后小鼠大腦、小腦、海馬中NOS活性增加[8]。

2.3NO對免疫系統(tǒng)的作用巨噬細(xì)胞、炎性中性粒細(xì)胞、組織中免疫細(xì)胞等被內(nèi)毒素或T細(xì)胞激活,表達(dá)iN-OS的mRNA,生成的iNOS催化產(chǎn)生大量NO。內(nèi)源性NO是巨噬細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的信使分子,它通過非特異性免疫機(jī)制對抗侵入機(jī)體的微生物和病原體。肺和肝是機(jī)體循環(huán)路徑中的主要免疫濾過器,其非特異性免疫功能依賴于NO。NO還具有免疫抑制作用,在植物血凝素刺激的淋巴細(xì)胞體外增殖反應(yīng)中,從巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO可抑制淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。許多細(xì)胞因子,如IL-1、IL-2、TNF和IFN以及某些細(xì)菌內(nèi)毒素可以單獨或聯(lián)合激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO,即正向調(diào)節(jié)。而另一些細(xì)胞因子如TGF-β、IL-4、IL-10、巨噬細(xì)胞滅活因子等可抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO,即負(fù)向調(diào)節(jié)。巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO對某些細(xì)胞因子的產(chǎn)生也具有調(diào)節(jié)作用。由此可見,作為免疫調(diào)節(jié)因子,NO的產(chǎn)生受細(xì)胞因子嚴(yán)密調(diào)節(jié),處于復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)監(jiān)視之中。

2.4NO對呼吸系統(tǒng)的作用NO可使氣管、支氣管平滑肌松弛。低濃度(5×10-6)吸入NO或霧化吸入釋放NO的復(fù)合物是強(qiáng)有力的支氣管擴(kuò)張劑,可用于臨床治療支氣管哮喘等疾病。20×10-6的NO可有效預(yù)防成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)[9],且在一定濃度范圍內(nèi),濃度越高作用越明顯。急性肺損傷時,由于LPS及多種細(xì)胞因子的作用,iNOS被激活,血漿及呼出氣中NO濃度升高。多量的內(nèi)源性NO有雙重作用,一方面通過血管平滑肌擴(kuò)張、心肌收縮力下降、多種代謝酶功能紊亂等而具有損害作用;另一方面通過降低肺動脈壓、減少血小板粘附及白細(xì)胞出游等發(fā)揮有利作用。但吸入適量NO可選擇性降低肺動脈高壓,改善氧合作用,而對體循環(huán)無影響。在慢性支氣管炎中,NO生成也增多。目前,測量上呼吸道NO已成為一項新的診斷指標(biāo)。另外,吸入NO對早產(chǎn)兒和新生兒ARDS的救治也有效。最近發(fā)現(xiàn),NO是呼吸道上皮細(xì)胞離子通道的調(diào)節(jié)器,它在呼吸道疾病及其防御中發(fā)揮重要作用[10]。

2.5NO對消化系統(tǒng)的作用NO是胃腸道NANC神經(jīng)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之一,對食管收縮或舒張功能、食管括約肌功能及食管蠕動功能有調(diào)控作用。免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn),NOS分布在腸系膜神經(jīng)叢、神經(jīng)軸突和腸粘膜。NO對胃腸道粘膜具有重要保護(hù)作用,如局部胃粘膜應(yīng)用NO溶液或硝酸甘油、SNP等,能減輕酒精引起的胃粘膜出血。臨床上治療胃潰瘍的藥物生胃酮,就是通過釋放NO而發(fā)揮對胃粘膜的保護(hù)作用的。應(yīng)激性胃粘膜損傷時,粘膜血流量明顯下降,粘膜通透性增加,血漿及粘膜NO含量明顯升高,用L-NAME可明顯加重粘膜損傷,并阻抑應(yīng)激所致的血漿及粘膜內(nèi)NO含量升高,使粘膜血流量更趨下降,而L-Arg可逆轉(zhuǎn)L-NAME的作用[11]。nNOS和eNOS誘導(dǎo)產(chǎn)生的NO,主要通過胃粘膜血流、上皮細(xì)胞分泌和屏障功能,保持胃腸粘膜完整性;而iNOS誘導(dǎo)產(chǎn)生的NO與胃腸道組織損傷有關(guān)[12]。NO對肝細(xì)胞功能、肝臟毒性和肝硬化的血液動力學(xué)也起重要調(diào)節(jié)作用。

3NO與寄生蟲感染

NO在瘧原蟲感染中的作用比較復(fù)雜。NO一方面可殺傷瘧原蟲,對宿主起保護(hù)作用;另一方面過量生成的NO又對宿主產(chǎn)生毒副作用。肝細(xì)胞對瘧原蟲子孢子的殺傷作用是L-Arg依賴性的。在瘧原蟲裂體增殖期間,宿主免疫細(xì)胞可產(chǎn)生NO以殺傷裂殖子,L-Arg的拮抗劑能減弱這種殺傷作用。感染瘧原蟲的小鼠血漿內(nèi)的NO2-水平明顯高于正常小鼠[13]。由于瘧原蟲誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的NOS活性明顯升高,可引起腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生大量NO,NO擴(kuò)散到周圍神經(jīng)元,從而干擾正常的神經(jīng)傳導(dǎo)。用滅活的曼氏血吸蟲尾蚴接種于小鼠,其皮膚內(nèi)iN-OS表達(dá)水平明顯升高。用NO合成抑制劑氨基胍處理小鼠,其對血吸蟲尾蚴感染的抵抗力明顯降低[14]。山羊感染肝片吸蟲第3周,血漿中的NO和TNF-α開始升高,它們作為炎性介質(zhì)可能參與了肝片吸蟲對肝的損害過程。因為NO和TNF-α對寄生蟲也有抑殺作用,所以二者還與宿主抗肝片吸蟲的機(jī)制有關(guān)[15]。NO對細(xì)胞內(nèi)克氏錐蟲有殺傷作用。應(yīng)用NOS抑制劑NG-單甲基-L-精氨酸(L-NMMA)后,NO生成減少,殺傷錐蟲作用減弱,錐蟲血癥發(fā)生率及動物死亡率均增加[16]。雞感染球蟲后,血漿NO2-水平明顯升高,但并不隨球蟲感染劑量的增加而增加,與蟲株毒力大小也無直接關(guān)系[17]。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)從1997年開始進(jìn)行NO與球蟲感染關(guān)系研究,結(jié)果表明,雛雞感染柔嫩艾美耳球蟲或堆型艾美耳球蟲后,血漿NO2-水平均明顯升高。eNOS抑制劑L-NAME、L-NA和iNOS抑制劑L-AG均能降低感染球蟲雛雞血漿NO2-水平和NOS活性。

4NO與腫瘤

NO在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等過程中均起作用,但對于不同的腫瘤類型,隨時間、部位及局部濃度的不同,NO的作用也很復(fù)雜。肺腺癌組織中,總NOS活性比正常肺高。人卵巢腫瘤中有iNOS表達(dá),且其活性與腫瘤的分化程度相關(guān),高分化卵巢癌iNOS活性比中分化和低分化者高。慢性肝炎繼發(fā)肝癌(HCC)病人,血清中NO水平明顯高于非HCC者,也明顯高于肝硬化并發(fā)HCC者。而在乳腺癌中,NO的水平則低于正常。腫瘤中少量NO的產(chǎn)生可增加腫瘤血流量并促進(jìn)血管新生,如轉(zhuǎn)染了NOS基因的人結(jié)腸癌細(xì)胞系,較其來源組織生長快且血管分化程度也高[18]。NO還可促進(jìn)前列腺素PGE2的合成。PGE2有促進(jìn)血管生成作用,同時可增強(qiáng)血管通透性,有利于腫瘤組織攝取營養(yǎng)。但NO在腫瘤起始及演進(jìn)過程中的作用機(jī)制仍不甚清楚。NO具有殺瘤和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的效應(yīng)。原發(fā)性肺癌病人的肺泡巨噬細(xì)胞由于iNOS活性增加,NO生成顯著高于對照組[19]?？ń槊?BCG)可用于膀胱癌的治療,但NOS抑制劑可拮抗BCG的療效。通過將iNOS轉(zhuǎn)染到轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)能極大地減少轉(zhuǎn)移,表明腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的NO可降低其轉(zhuǎn)移潛能。宿主細(xì)胞產(chǎn)生的NO也能通過阻止循環(huán)中的瘤細(xì)胞對血管內(nèi)皮的粘附而抑制轉(zhuǎn)移,小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的NO可抑制腫瘤的腦部轉(zhuǎn)移。因此,通過轉(zhuǎn)染iNOS可能成為殺傷腫瘤細(xì)胞和控制腫瘤轉(zhuǎn)移的有效途徑[20]。NO參與腫瘤細(xì)胞的凋亡過程。50%以上腫瘤可檢測到p53基因突變,NO引起DNA損傷也促使p53蛋白積聚而使細(xì)胞生長抑制乃至引發(fā)凋亡[21]。隨著NO在腫瘤生物學(xué)研究的深入,將對腫瘤發(fā)病及其治療提供有益的啟示。

5NO的毒理學(xué)

內(nèi)源性NO以pmol/L或fmol/L濃度存在時,可激活G蛋白,參與信息傳遞。以nmol/L濃度存在時,則誘發(fā)細(xì)胞毒性和損傷DNA,導(dǎo)致基因突變和癌變。同時,NO還能抑制某些與細(xì)胞呼吸和DNA復(fù)制有關(guān)的關(guān)鍵酶活性,使細(xì)胞能量代謝和DNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄發(fā)生障礙,從而影響細(xì)胞的生長、發(fā)育和分化。另外,NO的一系列氧化還原形式,一方面作為還原物質(zhì)清除引起脂質(zhì)過氧化發(fā)生的物質(zhì),另一方面也介導(dǎo)、引發(fā)脂質(zhì)過氧化發(fā)生。吸入NO時,產(chǎn)生的過亞硝酸鹽對肺泡表面活性物質(zhì)的功能有不良影響。TK6人成淋巴細(xì)胞接觸NO(5.5～22mmol/L)后,其DNA單鏈斷裂,并隨著劑量的升高和時間的延長而增加[22]?；罨奘杉?xì)胞產(chǎn)生的NO也誘發(fā)靶細(xì)胞中DNA鏈斷裂,這種損傷可被L-NMMA抑制。NO通過氧化使胺亞硝基化,進(jìn)而使DNA、RNA、腺嘌呤和鳥嘌呤發(fā)生脫氨基作用,產(chǎn)生的脫氨產(chǎn)物隨NO濃度增加而增加。NO對培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞有誘變作用。在TK6細(xì)胞培養(yǎng)時,直接通以5.5～22mmol/LNO1h,經(jīng)6d表達(dá),NO誘發(fā)TK基因位點和HPRT基因位點突變,并與濃度有依賴關(guān)系。SD大鼠吸入一定濃度的NO,將其肺細(xì)胞原代培養(yǎng),結(jié)果也表現(xiàn)出誘變性。NO供體藥物SNP能誘發(fā)g12細(xì)胞gpt位點突變和雙微核形成,并與NO2-含量升高呈正相關(guān)。提示SNP釋放的NO過量積累可能是導(dǎo)致g12細(xì)胞遺傳毒性的主要原因。NO是沙門氏菌TA1535的強(qiáng)誘變劑。在NO濃度為12.3mg/m3時,回復(fù)突變數(shù)為本底的10倍,回變體隨劑量增加和接觸時間延長而增加,TA1535基因突變譜多是C→T轉(zhuǎn)換。NO供體藥物能誘導(dǎo)TA1535回復(fù)突變,其中精氨-NO復(fù)合物誘發(fā)的回變率可高達(dá)本底的100倍[23]。NO表現(xiàn)出的致突變性與DNA堿基脫氨和錯誤修復(fù)以及自由基致DNA氧化損傷有密切關(guān)系。

6結(jié)語

NO具有廣泛的化學(xué)反應(yīng)性和作用位點,介導(dǎo)和調(diào)節(jié)許多器官系統(tǒng)的生理、病理生理功能。它是一把雙刃劍,即有作為生物信使和免疫調(diào)節(jié)的有利的一面,也有潛在的毒性。目前國內(nèi)有關(guān)NO及NOS的研究報道正逐年增多,但在獸醫(yī)界自1997年后才由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)在NO與寄生蟲感染方面開始研究,更多的研究仍在機(jī)理方面。雖然有NO混合氣體直接吸入、NO供體藥物和NOS抑制劑治療諸多疾病的報道,但距實際臨床應(yīng)用仍有一定距離,其有效性和安全性仍需進(jìn)一步評估。綜上所述,應(yīng)考慮在以下幾個方面開展研究工作。(1)探討在某一條件或處置前后,動物、器官、組織或細(xì)胞NO含量和NOS活性的改變,及NO供體藥物和NOS抑制劑對生理和病理生理的影響,以揭示機(jī)理,拓展思路,為疾病防治提供依據(jù)。(2)開展NOS的分子生物學(xué)研究。包括NOS組織定位、提取純化及分型、基因序列分析、檢測NOSmRNA、克隆NOS基因,通過載體使基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞,用于某些治療目的等。(3)開展NO供體和NOS抑制劑的藥理毒理學(xué)研究,開展已有藥物的NO/NOS機(jī)制研究,為藥物作用機(jī)理和新藥研發(fā)提供依據(jù)和方法。