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本文作者：丹彤包秋華孟和畢力格王俊國(guó)張和平作者單位：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

乳酸細(xì)菌廣泛分布于自然界中，是一類利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌通稱。傳統(tǒng)發(fā)酵乳食品中分離的乳酸菌一般被認(rèn)為是安全的細(xì)菌，早在人們認(rèn)識(shí)乳酸菌之前，就已將其廣泛應(yīng)用于發(fā)酵酸乳、制作奶酪、食品防腐、保藏等方面。這些乳酸菌在酸奶發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，包括乳酸、胞外多糖、風(fēng)味物質(zhì)以及人體營(yíng)養(yǎng)所必需的多種維生素等。這些菌體及其代謝產(chǎn)物具有改善乳制品的風(fēng)味，提高制品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，維持和保證腸道菌群最佳優(yōu)勢(shì)組合及穩(wěn)定性，抑制腫瘤和免疫賦活等生理功能[1]。酸奶是以新鮮的牛奶為原料，經(jīng)過(guò)2種或2種以上的乳酸菌發(fā)酵制成的產(chǎn)品。目前，主要應(yīng)用于酸奶制造的乳酸菌發(fā)酵劑有保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌。這2種發(fā)酵劑在酸奶發(fā)酵過(guò)程中相互作用，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物賦予發(fā)酵乳特有的風(fēng)味、質(zhì)地、口感和營(yíng)養(yǎng)價(jià)値。發(fā)酵乳中風(fēng)味物質(zhì)的成分及含量受諸多因素的影響，其風(fēng)味物質(zhì)的形成主要受原料中成分、加工過(guò)程中條件變化及發(fā)酵劑種類的影響。為了提高乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中生產(chǎn)主要風(fēng)味物質(zhì)乙醛、雙乙酰的能力，國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者對(duì)乳酸菌合成乙醛、雙乙酰的代謝途徑及其代謝調(diào)控方式開展了大量的研究工作。這篇綜述主要描述了乳酸菌在酸奶發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)，以及主要風(fēng)味物質(zhì)乙醛、雙乙酰的代謝途徑和其調(diào)控機(jī)制。

1酸奶發(fā)酵劑生產(chǎn)的風(fēng)味物質(zhì)

乳酸菌在碳水化合物的代謝過(guò)程中能生產(chǎn)乙醛、丙酮、乙偶姻、雙乙酰等多種揮發(fā)性芳香化合物[2]。這些風(fēng)味物質(zhì)主要由揮發(fā)性、非揮發(fā)性酸以及羰基化合物組成，其中，羰基化合物對(duì)發(fā)酵乳的風(fēng)味有顯著影響。在單一乳酸菌發(fā)酵的發(fā)酵乳中，主要羰基化合物的含量為乙醛(2.0~41.0μg/mL)、雙乙酰(0.2~2.3μg/mL)、乙偶姻(2.2~28.2μg/mL)、乙醇(0.2~9.9μg/mL)以及丙酮(1.8~3.4μg/mL)[2]。這些羰基化合物在發(fā)酵乳中的含量和種類決定著產(chǎn)品的風(fēng)味。在酸奶的發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌生產(chǎn)的風(fēng)味物質(zhì)種類繁多，除上述風(fēng)味物質(zhì)之外，還有很多生產(chǎn)量很低的芳香化合物。這些芳香化合物因?yàn)樾嵊X(jué)閾值的差異，很難評(píng)價(jià)它們?cè)谛纬伤崮田L(fēng)味中的作用。Ott等[3]在酸奶中首次發(fā)現(xiàn)了有強(qiáng)烈氣味的1-辛烯-3-酮、1-壬烯-3-酮、3-甲硫基丙醛、2-甲基四氫噻吩-3-酮、2E-壬烯醛以及愈瘡木酚等6種化合物。在這項(xiàng)研究中，作者首次使用光譜分析法鑒定了1-壬烯-3-酮。1-壬烯-3-酮在酸奶中的含量很低，但由于1-壬烯-3-酮在酸乳中很低的香氣閾值并不影響該化合物在形成酸奶風(fēng)味中的作用。乙醛是乳酸菌在酸奶發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的特征風(fēng)味物質(zhì)，在酸奶中的含量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他揮發(fā)性芳香化合物。目前，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的酸奶主要是以乙醛風(fēng)味為主的醛香性酸奶。在形成發(fā)酵乳制品的滋味與香味的風(fēng)味物質(zhì)中，雙乙酰(又名丁二酮)也被認(rèn)為是起關(guān)鍵作用的重要芳香化合物之一，是奶油、干酪、奶酪、酸奶以及很多需要奶油味的非乳產(chǎn)品中的一種重要風(fēng)味物質(zhì)。一般認(rèn)為，酸奶中主要風(fēng)味物質(zhì)乙醛由保加利亞乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生，雙乙酰由嗜熱鏈球菌發(fā)酵產(chǎn)生[4]。當(dāng)酸奶中乙醛含量低時(shí)，雙乙酰在發(fā)酵乳中占主導(dǎo)地位，形成具有獨(dú)特奶香味的發(fā)酵乳[5]。Rysstad等[6]發(fā)現(xiàn)在山羊乳酸奶中乙醛含量明顯低于普通酸奶，而雙乙酰的含量和普通酸奶中的雙乙酰的含量基本相同，說(shuō)明在山羊乳酸奶的風(fēng)味物質(zhì)中，雙乙酰是起關(guān)鍵作用的重要芳香化合物。目前，關(guān)于酸奶風(fēng)味物質(zhì)的代謝調(diào)控研究主要集中在乙醛、雙乙酰等主要的風(fēng)味物質(zhì)上。

2乙醛的合成途徑及其基因調(diào)控

發(fā)酵乳中乙醛的含量是評(píng)價(jià)酸奶質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。早在1950年P(guān)ette等[7]就提出了乙醛是形成酸奶風(fēng)味物質(zhì)的主要成分。Hamdan等[8]也得出了類似結(jié)論，指出高濃度的乙醛是形成酸奶良好風(fēng)味的重要前提。Sandine等[9]報(bào)道了在發(fā)酵乳中乙醛的濃度只有高于8mg/L時(shí)，才能產(chǎn)生具有良好風(fēng)味的發(fā)酵乳。發(fā)酵劑菌株的質(zhì)量和活力對(duì)酸奶質(zhì)量及酸奶中風(fēng)味物質(zhì)的含量起著關(guān)鍵性的作用。利用基因工程和代謝工程技術(shù)改良現(xiàn)有的發(fā)酵劑菌株，構(gòu)建高產(chǎn)乙醛的菌株，是國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)之一。

2.1乙醛的合成途徑

在乳酸菌生產(chǎn)乳酸的發(fā)酵過(guò)程中，乙醛可由氨基酸、核酸及丙酮酸代謝產(chǎn)生(圖1)。在乳酸菌的碳代謝過(guò)程中，丙酮酸是重要的代謝中間產(chǎn)物。乳糖經(jīng)糖酵解途徑生成丙酮酸，丙酮酸在丙酮酸脫羧酶(PDC)的催化作用下合成乙醛。丙酮酸還可在甲酸裂解酶(PFI)和丙酮酸脫氫酶(PDH)的催化作用下，轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A，生成的乙酰輔酶A在乙醛脫氫酶(ADH)的催化作用下，生成乙醛。在酸奶發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌生產(chǎn)乙醛的代謝途徑和菌體自身的酶有關(guān)。例如丙酮酸脫羧酶多發(fā)現(xiàn)于釀酒酵母和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中，在酸奶發(fā)酵劑保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌中幾乎沒(méi)有關(guān)于丙酮酸脫羧酶的報(bào)道。Raya等[10]在2株保加利亞乳桿菌和2株嗜熱鏈球菌中，都沒(méi)有檢測(cè)出丙酮酸脫羧酶活性。說(shuō)明在酸奶發(fā)酵過(guò)程中，丙酮酸生成乙醛或丙酮酸經(jīng)由乙酰輔酶A生成乙醛的代謝途徑可能不存在。脫氧核糖5-磷酸在脫氧核糖醛縮酶(DERA)的催化作用下生成乙醛和3-磷酸甘油醛，并且這個(gè)催化過(guò)程是可逆的。很多菌種都有關(guān)于具有脫氧核糖醛縮酶的報(bào)道。Kim等[11]對(duì)來(lái)源于類芽孢桿菌的脫氧核糖醛縮酶做了詳細(xì)研究。該酶和來(lái)源于地芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌的脫氧核糖醛縮酶有很高的同源性。酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定的結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)基中乙醛濃度為100mmol/L時(shí)，脫氧核糖5-磷酸的產(chǎn)量達(dá)到最高，說(shuō)明脫氧核糖醛縮酶能催化脫氧核糖5-磷酸和乙醛之間的轉(zhuǎn)化。Raya等[10]也報(bào)道了在保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的發(fā)酵過(guò)程中檢測(cè)出明顯的脫氧核糖醛縮酶活性，說(shuō)明在酸奶發(fā)酵過(guò)程中，脫氧核糖5-磷酸生成乙醛的代謝途徑可能存在。在酸奶發(fā)酵過(guò)程中有些氨基酸先轉(zhuǎn)化成中間體代謝產(chǎn)物丙酮酸然后合成乙醛，但也有些氨基酸如蘇氨酸在蘇氨酸醛縮酶(TA)酶的催化作用下可直接降解生成乙醛。其中，蘇氨酸生成乙醛被認(rèn)為是乳酸菌生產(chǎn)乙醛的主要代謝途徑。蘇氨酸醛縮酶廣泛存在于自然界生物體內(nèi)，在保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌中均有關(guān)于具有蘇氨酸醛縮酶活性的報(bào)道。國(guó)內(nèi)外一些研究學(xué)者把研究乙醛代謝途徑的焦點(diǎn)集中在蘇氨酸醛縮酶上，對(duì)蘇氨酸醛縮酶的調(diào)控做了大量的研究工作。在乙醛的代謝途徑中，乙醛在乙醛還原酶(ALDH)催化作用下生成乙醇，降低酸奶中乙醛的含量。Koo等[12]對(duì)腸膜明串珠菌的乙醛還原酶和乙醛脫氫酶做了詳細(xì)的研究。認(rèn)為在腸膜明串珠菌中，乙醛還原酶和乙醛脫氫酶醛是一個(gè)多功能酶(醛醇脫氫酶，ADHE)，編碼醛醇脫氫酶的adhE基因全長(zhǎng)2685bp，編碼886個(gè)氨基酸，序列分析的結(jié)果表明該酶的氨基酸序列和其他已發(fā)表的氨基酸序列有很高的相似性。在推導(dǎo)出的醛醇脫氫酶氨基酸序列上發(fā)現(xiàn)2個(gè)保守區(qū)域，分別編碼乙醇脫氫酶(ADH)和乙醛還原酶(ALDH)。Koo等[12]還將adhE基因克隆到表達(dá)質(zhì)粒中，然后轉(zhuǎn)入到EscherichiacoliBL21，構(gòu)建了醛醇脫氫酶基因工程菌。酶活檢測(cè)結(jié)果表明，醛醇脫氫酶具有乙醇脫氫酶和乙醛還原酶的活性。在其他乳酸菌中也有很多關(guān)于乙醛還原酶和乙醛脫氫酶活性的報(bào)道。Raya等[10]在2株保加利亞乳桿菌和2株嗜熱鏈球菌的發(fā)酵過(guò)程中都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的乙醛脫氫酶活性，但從其他2株嗜熱鏈球菌中卻檢測(cè)出明顯的乙醛還原酶活性。說(shuō)明在一些嗜熱鏈球菌中，生產(chǎn)的乙醛有可能作為中間產(chǎn)物在乙醛還原酶的催化作用下被還原成乙醇，從而降低發(fā)酵乳中風(fēng)味物質(zhì)的含量。

2.2乙醛的基因調(diào)控

蘇氨酸在蘇氨酸醛縮酶的催化作用下生成乙醛的代謝通路被認(rèn)為是乳酸菌生成乙醛的主要代謝途徑，受到國(guó)內(nèi)外一些研究學(xué)者的廣泛關(guān)注。Chaves等[13]報(bào)道了在嗜熱鏈球菌中，具有蘇氨酸醛縮酶活性的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(SHMT)能催化蘇氨酸和甘氨酸、乙醛之間的相互轉(zhuǎn)化。Chaves等在培養(yǎng)基中補(bǔ)充適量的L-蘇氨酸，發(fā)酵后乙醛的含量明顯增加，說(shuō)明在這項(xiàng)研究中使用的嗜熱鏈球菌具有蘇氨酸醛縮酶的活性，在發(fā)酵過(guò)程中能過(guò)分解過(guò)量的L-蘇氨酸生成乙醛。在這項(xiàng)研究中作者還構(gòu)建了編碼SHMT的glyA基因缺陷菌株，發(fā)現(xiàn)glyA基因缺陷菌株在酸奶發(fā)酵過(guò)程中乙醛生成量明顯低于野生菌株，說(shuō)明蘇氨酸生成乙醛的代謝途徑是乳酸菌生產(chǎn)乙醛的主要代謝途徑。蘇氨酸醛縮酶的活性很不穩(wěn)定，容易受外界條件的影響。Lees等[14]報(bào)道了當(dāng)培養(yǎng)溫度從30℃上升到37℃或42℃時(shí)，嗜熱鏈球菌蘇氨酸醛縮酶的活力明顯下降，而保加利亞乳桿菌蘇氨酸醛縮酶具有耐熱性，在42℃的培養(yǎng)條件下，依然能保持很高的活力。酸奶的發(fā)酵一般是在43℃培養(yǎng)溫度下進(jìn)行，在這個(gè)培養(yǎng)溫度下，保加利亞乳桿菌蘇氨酸醛縮酶的活力要高于嗜熱鏈球菌蘇氨酸醛縮酶的活力，一般認(rèn)為酸奶發(fā)酵過(guò)程中生產(chǎn)的乙醛主要來(lái)源于保加利亞乳桿菌。在乙醛代謝途徑中，還有一些關(guān)鍵酶在乙醛代謝過(guò)程中起著調(diào)控作用。Bongers等[15]在乳酸乳球菌中成功地表達(dá)了來(lái)源于運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中的pdc基因(編碼丙酮酸脫羧酶)和來(lái)源于乳酸乳球菌的nox基因(編碼NADH氧化酶)，大幅度提高了發(fā)酵乳中乙醛的產(chǎn)量。目前，對(duì)乙醛基因工程方面的研究主要集中在glyA、pdc、nox等幾個(gè)主要基因的調(diào)控上。在一些乳制品中，在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的乙醛容易被乙醛還原酶還原成乙醇，降低了乳制品中乙醛的含量。因此，利用現(xiàn)代生物技術(shù)改變?nèi)樗峋幸胰┑拇x通路，在篩選、構(gòu)建乙醛還原酶缺陷型菌株的基礎(chǔ)上，過(guò)量表達(dá)一些關(guān)鍵基因，可以提高乳制品中乙醛的產(chǎn)量。當(dāng)然，這些嘗試也為酸奶、奶酪等乳制品的開發(fā)提供廣闊前景。

3雙乙酰的合成途徑及其基因調(diào)控

雙乙酰作為酸奶中主要風(fēng)味物質(zhì)，在形成酸奶風(fēng)味中起著重要作用。雙乙酰一般由嗜溫乳酸球菌生產(chǎn)，包括乳酸乳球菌丁二酮亞種、腸膜明串珠菌腸膜亞種、鏈球菌和熱鏈球菌等[4]。但也有學(xué)者認(rèn)為在酸奶發(fā)酵過(guò)程中保加利亞乳桿菌是生產(chǎn)雙乙酰的主要菌株[8]。目前，關(guān)于乳酸菌風(fēng)味物質(zhì)雙乙酰的研究工作大多集中于雙乙酰的合成途徑及其產(chǎn)量調(diào)控上。

3.1雙乙酰的合成途徑

在乳酸菌中生成雙乙酰的代謝途徑主要有檸檬酸代謝途徑和糖酵解代謝途經(jīng)。一些乳酸菌特別是乳球菌能利用乳糖、檸檬酸生成丙酮酸，再合成雙乙酰(圖1)。在乳糖合成雙乙酰的代謝途徑中，過(guò)量的丙酮酸在α-乙酰乳酸合成酶(α-ALS)的作用下合成α-乙酰乳酸乳酸。α-乙酰乳酸在酸性條件下，化學(xué)氧化脫羧生成雙乙酰。雙乙酰很不穩(wěn)定，在雙乙酰還原酶(AR)的催化作用被還原為乙偶姻。在檸檬酸生成雙乙酰的代謝途徑中，丙酮酸和α-乙酰乳酸是重要的中間產(chǎn)物。檸檬酸在檸檬酸裂解酶的催化作用下生成草酰乙酸，草酰乙酸可直接生成α-乙酰乳酸，也可通過(guò)脫羧反應(yīng)生成丙酮酸。丙酮酸進(jìn)一步脫羧生成活性乙醛(乙醛-TPP)，活性乙醛與丙酮酸在α-乙酰乳酸合成酶作用下合成α-乙酰乳酸,通過(guò)化學(xué)氧化脫羧作用生成雙乙酰。α-乙酰乳酸也可在α-乙酰乳酸脫羧酶(α-ALDC)的作用下脫羧生成乙偶姻。由于牛奶中檸檬酸的含量很低，一般認(rèn)為發(fā)酵乳中的雙乙酰主要通過(guò)糖酵解代謝途徑生成。

3.2雙乙酰的基因調(diào)控

在酸奶發(fā)酵過(guò)程中雙乙酰產(chǎn)量和幾個(gè)關(guān)鍵酶的活力密切相關(guān)，這些酶包括：檸檬酸裂解酶(ACLY)、草酰乙酸脫羧酶(OXAD)、α-乙酰合成酶、NADH氧化酶(NOX)、α-乙酰乳酸脫羧酶、雙乙酰還原酶等。運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)使這些酶失活或超量表達(dá)，能增加中間產(chǎn)物丙酮酸、α-乙酰乳酸的積累，能改變雙乙酰代謝途徑，提高雙乙酰的產(chǎn)量。其中，國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者為了改變?chǔ)?乙酰乳酸流向乙偶姻的代謝通路，把研究的重點(diǎn)集中在篩選、構(gòu)建一些α-乙酰乳酸脫羧酶缺陷型菌株上。Aymes等[16]用隨機(jī)誘變的方法篩選出α-乙酰乳酸脫羧酶缺陷型的乳酸乳球菌丁二酮亞種菌株，在厭氧條件下，雙乙酰的產(chǎn)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于野生菌株雙乙酰的產(chǎn)量。Monnet等[17]為提高嗜熱鏈球菌雙乙酰的產(chǎn)量，在添加α-酮基丁酸、亮氨酸或α-酮基丁酸、亮氨酸、異亮氨酸的培養(yǎng)基上，用定向突變方法挑選出α-乙酰乳酸脫羧酶缺陷型的嗜熱鏈球菌。在微氧條件下，α-乙酰乳酸脫羧酶缺陷型菌株雙乙酰的產(chǎn)量比野生菌株提高了近3倍。一些研究學(xué)者在篩選、構(gòu)建α-乙酰乳酸脫羧酶缺陷型菌株的基礎(chǔ)上，還對(duì)上述的一些調(diào)控雙乙酰生產(chǎn)的關(guān)鍵基因進(jìn)行超量表達(dá)，運(yùn)用聯(lián)合調(diào)控等方法對(duì)提高雙乙酰的產(chǎn)量進(jìn)行了嘗試。Hugenholtz等[18]在α-乙酰乳酸脫羧酶缺陷型的乳酸乳球菌中，在有氧條件下超量表達(dá)調(diào)控NADH氧化酶的nox基因，大幅度提高了雙乙酰的產(chǎn)量。目前關(guān)于雙乙酰的基因調(diào)控的研究大多集中在糖酵解、檸檬酸代謝途徑的一些關(guān)鍵基因的調(diào)控上，隨著這些研究的深入應(yīng)該能生產(chǎn)出更多符合消費(fèi)者需求的新產(chǎn)品。

4存在的問(wèn)題及展望

在酸奶生產(chǎn)過(guò)程中，發(fā)酵劑的作用非常重要，是酸奶產(chǎn)品產(chǎn)酸和產(chǎn)香的基礎(chǔ)和原因。酸奶質(zhì)量的好壞主要取決于酸奶發(fā)酵劑的品質(zhì)類型及活力[19]。通常使用的酸奶發(fā)酵劑保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌在代謝過(guò)程中能維持良好的共生關(guān)系，使酸奶獲得良好的風(fēng)味。但兩個(gè)菌種的許多菌株也存在著不同程度的拮抗作用，在代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸、雙乙酰、過(guò)氧化氫、細(xì)菌素等生長(zhǎng)抑制因子，影響發(fā)酵劑的平衡生長(zhǎng)，導(dǎo)致嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌間表現(xiàn)出非協(xié)同生長(zhǎng)的現(xiàn)象，影響酸奶的風(fēng)味質(zhì)量。酸奶的風(fēng)味不僅受發(fā)酵劑種類的影響，還受接種量、培養(yǎng)條件以及風(fēng)味物質(zhì)的種類、含量和比例的等多各種因素的影響[20]。雖然酸奶中發(fā)酵劑仍存在一些問(wèn)題，但隨著人們對(duì)乳酸菌風(fēng)味物質(zhì)代謝途徑的深入了解及分子生物技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程手段改良現(xiàn)有的發(fā)酵菌種和挖掘新的發(fā)酵菌種，選育出能適合工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)良發(fā)酵劑菌株，不斷提高酸奶的風(fēng)味質(zhì)量，促進(jìn)乳制品工業(yè)的發(fā)展。