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“三角形的特性”是人教版四年級(jí)下冊(cè)的內(nèi)容,是在學(xué)生已經(jīng)認(rèn)識(shí)三角形的基礎(chǔ)上進(jìn)行教學(xué)的。品讀了兩位教師的”三角形的特性”教學(xué)設(shè)計(jì)后,深深地感受到了兩位教師深厚的文化底蘊(yùn),豐實(shí)的數(shù)學(xué)素養(yǎng),鮮明的教學(xué)個(gè)性,令人回味無(wú)窮。雖是同一教學(xué)內(nèi)容,由于老師的不同,所設(shè)計(jì)課的結(jié)構(gòu)、風(fēng)格及所采取的教學(xué)方法和策略都不盡相同,呈現(xiàn)給我們的是獨(dú)具匠心、各具特色的兩節(jié)課。兩節(jié)課“同中求異、異中求同”,教師的教學(xué)個(gè)性彰顯無(wú)疑。
這部分教學(xué)內(nèi)容屬于“圖形與幾何”領(lǐng)域,張翠穎老師和李欣兩位老師通過(guò)對(duì)課標(biāo)的學(xué)習(xí),都精心地設(shè)計(jì)了“三角形的特性”一課。有幸的是我親自聆聽(tīng)了張老師的這節(jié)課,并與張老師交換了意見(jiàn)。兩位老師都是始終圍繞著以“問(wèn)題情境——實(shí)踐探究——解釋、應(yīng)用”的基本模式來(lái)開(kāi)展自主探究、動(dòng)手實(shí)踐、合作交流的數(shù)學(xué)教學(xué)活動(dòng)。讓學(xué)生經(jīng)歷“數(shù)學(xué)化”的學(xué)習(xí)過(guò)程。遵循學(xué)生的認(rèn)知規(guī)律,注重學(xué)生已有的生活經(jīng)驗(yàn),尊重學(xué)生對(duì)問(wèn)題的獨(dú)到見(jiàn)解,關(guān)注學(xué)生的感受、體驗(yàn)。力爭(zhēng)把數(shù)學(xué)課堂還原給學(xué)生,使學(xué)生真正成為數(shù)學(xué)學(xué)習(xí)活動(dòng)的主人。感受到了她們相同的思想方法和理念,同時(shí)也能感受到不同的設(shè)計(jì)和風(fēng)格。
一、聯(lián)系生活,提出質(zhì)疑
在導(dǎo)入部分兩位老師都設(shè)計(jì)了情境教學(xué),并采取了出示大致相同的生活圖片如塔吊、斜拉橋、自行車(chē)等圖片讓學(xué)生觀察,從而揭示出三角形來(lái)。聯(lián)系生活實(shí)際,借助學(xué)生已有的生活經(jīng)驗(yàn),讓學(xué)生再找出生活中還有哪些物體上有三角形。同時(shí)提出問(wèn)題:這些物體為什么要做成三角形的呢?數(shù)學(xué)教學(xué)必須從學(xué)生熟悉的生活情境和感興趣的事物出發(fā),為他們提供參與的機(jī)會(huì),為他們創(chuàng)設(shè)一個(gè)發(fā)展的空間。以此激發(fā)學(xué)生的求知欲,讓他們?cè)谏钪型ㄟ^(guò)觀察去發(fā)現(xiàn)問(wèn)題,并提出問(wèn)題。在導(dǎo)入部分,兩位老師的教學(xué)設(shè)計(jì)可以看出情境和思路都是相同的。關(guān)于“同課異構(gòu)”的話(huà)題曾經(jīng)也有人提過(guò)“同材異構(gòu)”“同標(biāo)異構(gòu)”,主要體現(xiàn)“異構(gòu)”,在這里的設(shè)計(jì)為什么是大致相同的呢?可以說(shuō)這樣的設(shè)計(jì)充分地體現(xiàn)出了課標(biāo)中“四能”中的前兩方面能力,為下面落實(shí)后兩方面能力做鋪墊。雖然設(shè)計(jì)大致相同,但是方法和風(fēng)格還是各有不同。
二、合作探究,分析問(wèn)題
數(shù)學(xué)學(xué)習(xí)是學(xué)生獲取知識(shí)的過(guò)程,是自我建構(gòu)的過(guò)程。本節(jié)課中,兩位精心設(shè)計(jì)探究活動(dòng),引導(dǎo)學(xué)生自主探究,努力改善學(xué)生的學(xué)習(xí)方式,使他們?nèi)硇牡赝度氲綌?shù)學(xué)活動(dòng)中,在活動(dòng)中產(chǎn)生深刻的體驗(yàn),從而更好地掌握知識(shí)。這節(jié)課知識(shí)點(diǎn)多,包括三角形的概念、底和高的概念、各部分名稱(chēng),還有三角形的重要特性:穩(wěn)定性,及其在生活中的應(yīng)用。從課題看,特性無(wú)疑是重點(diǎn)。而底和高的概念、及高的作法是難點(diǎn),勢(shì)必會(huì)耽誤大量時(shí)間。如何在一堂課中完成教學(xué)任務(wù)?
張翠穎老師和李欣老師都采取了自主探究合作交流的方法,留給學(xué)生足夠的時(shí)間與空間,首先讓學(xué)生獨(dú)立思考,再采取合作交流的方式。使學(xué)生建立空間觀念,建立幾何直觀的思想,由具體直觀形象思維到抽象思維,最后總結(jié)概括出三角形的定義及底和高的概念。在集體操作過(guò)程中,兩位老師的教學(xué)方法各不相同:
張翠穎老師大膽地采取倒敘的設(shè)計(jì)。通過(guò)對(duì)教材的深入理解,結(jié)合學(xué)生的實(shí)際情況,教學(xué)中設(shè)計(jì)了許多操作和探究活動(dòng),并根據(jù)學(xué)生的活動(dòng)設(shè)計(jì)把教材例1和例2的內(nèi)容進(jìn)行了重組。教學(xué)中把例1中認(rèn)識(shí)三角形的底和高這部分教學(xué)內(nèi)容后移,把例1中認(rèn)識(shí)三角形的特征和例2三角形的特性安排在一起教學(xué),并設(shè)計(jì)了一系列的操作活動(dòng),使學(xué)生在畫(huà)一畫(huà)、看一看、找一找、拉一拉、想一想、說(shuō)一說(shuō)等活動(dòng)中認(rèn)識(shí)三角形的特征、了解三角形的特性及在實(shí)際生活中的應(yīng)用。在探究過(guò)程中,讓3名學(xué)生伸開(kāi)雙臂圍成三角形,張老師首先讓學(xué)生理解三角形定義,然后直接明確三角形的表示方法,再探究三角形的底和高。這樣做更容易在三角形中找出對(duì)應(yīng)的底和高。
李欣老師在三個(gè)探究活動(dòng)中采取了出示學(xué)習(xí)匯報(bào)單,請(qǐng)學(xué)生以小組為單位自主學(xué)習(xí)的方式。通過(guò)做(擺)三角形、畫(huà)三角、判斷三條線(xiàn)段圍成的是不是三角形,明確了什么是三角形。這個(gè)過(guò)程中讓學(xué)生明確探究要求,按步驟去合作探究,通過(guò)具體實(shí)例來(lái)完成三角形的定義。明確強(qiáng)調(diào)由三條線(xiàn)段圍成的圖形叫做三角形。之后再探究三角形的底和高,按照循序漸進(jìn)由淺入深的邏輯進(jìn)行教學(xué)。
關(guān)于三角形高的教學(xué),兩位老師的設(shè)計(jì)也不盡相同。張老師是采取了對(duì)應(yīng)的方法,并突出了直角三角形的兩條高,同時(shí)拓展到鈍角三角形高的畫(huà)法。李老師是通過(guò)對(duì)比、判斷的形式明確三角形的高,并且要求會(huì)畫(huà)三角形的高。
形象直觀、突破難點(diǎn)。在探究三角形穩(wěn)定性時(shí),張老師結(jié)合導(dǎo)入時(shí)提出的問(wèn)題“為什么這些物體要做成三角形的呢”,加以合理的解釋說(shuō)明,突出了三角形的穩(wěn)定性這一難點(diǎn),更確切地說(shuō)是三角形的牢固性和穩(wěn)固性。李老師利用對(duì)比的方法,利用學(xué)具讓學(xué)生動(dòng)手操作通過(guò)拉一拉的形式發(fā)現(xiàn)三角形比四邊形更穩(wěn)固,直觀形象地理解了三角形的穩(wěn)定性。
同樣是探究,而探究的要求、形式卻不相同,體現(xiàn)出了兩位老師的教學(xué)思路及教學(xué)風(fēng)格的獨(dú)到之處,卻達(dá)到了同樣的目的和效果。
三、回歸生活,解決問(wèn)題
兩位教師在教授新知之后都設(shè)計(jì)了不同的拓展練習(xí)。把當(dāng)堂所學(xué)習(xí)的知識(shí)當(dāng)堂消化,并且聯(lián)系生活運(yùn)用到生活中去,解決一些簡(jiǎn)單的實(shí)際問(wèn)題。張老師設(shè)計(jì)了椅子太搖晃了,怎樣才能固定住呢?讓學(xué)生來(lái)解決這個(gè)生活中的實(shí)際問(wèn)題。李老師提出了自行車(chē)車(chē)架運(yùn)用了三角形的穩(wěn)定性原理的問(wèn)題。同時(shí)兩位教師都列舉了關(guān)于三角形具有穩(wěn)定性的一些生活實(shí)例,以此讓學(xué)生更好地理解數(shù)學(xué)來(lái)源于生活并服務(wù)于生活。更加清晰地看到學(xué)習(xí)數(shù)學(xué)的重要性和學(xué)習(xí)數(shù)學(xué)的目的。
兩位教師的課堂教學(xué)讓我們清楚地看到了不同的教師對(duì)同一教材內(nèi)容的不同處理,不同的教學(xué)策略所產(chǎn)生的不同教學(xué)效果。不同的教師在設(shè)計(jì)“三角形的特性”的教學(xué)時(shí)還要從實(shí)際出發(fā),進(jìn)行合理的創(chuàng)編教材,把教材進(jìn)行重組。因此我們備課時(shí)重在“鎖定”新課標(biāo)、“吃透”教材、“聚焦”關(guān)鍵、“挖掘”智慧、多元解讀,實(shí)現(xiàn)教無(wú)定法,貴在得法,形成獨(dú)具特色的教學(xué)風(fēng)格。
等邊三角形是特殊的等腰三角形。等邊三角形(又稱(chēng)正三邊形),為三邊相等的三角形,其三個(gè)內(nèi)角相等,均為60°,它是銳角三角形的一種。等邊三角形也是最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。等邊三角形是特殊的等腰三角形,所以等邊三角形擁有等腰三角形的一切性質(zhì)。
三角形是由同一平面內(nèi)不在同一直線(xiàn)上的三條線(xiàn)段‘首尾’順次連接所組成的封閉圖形,在數(shù)學(xué)、建筑學(xué)有應(yīng)用。常見(jiàn)的三角形按邊分有普通三角形(三條邊都不相等),等腰三角(腰與底不等的等腰三角形、腰與底相等的等腰三角形即等邊三角形);按角分有直角三角形、銳角三角形、鈍角三角形等,其中銳角三角形和鈍角三角形統(tǒng)稱(chēng)斜三角形。
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【關(guān)鍵詞】淮劇;旦角;表演;特性;戲曲;劇種;人物
中圖分類(lèi)號(hào):J812 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1007-0125(2015)10-0039-02
表演藝術(shù)是中國(guó)戲曲的中心與生命,沒(méi)有表演藝術(shù)就只有紙上的戲曲劇本而沒(méi)有真正的舞臺(tái)上的戲曲藝術(shù),這與西方戲劇形成明顯的區(qū)別。對(duì)于這一點(diǎn),京劇大師程硯秋先生論述得十分明確而又精辟:“我國(guó)傳統(tǒng)表演藝術(shù)和西洋演劇的最大區(qū)別之一是,在舞臺(tái)藝術(shù)的整體中,我們把表演提到至高無(wú)上的地位。西方雖然也有表演中心論,而且是主要學(xué)派,但終不能像中國(guó)學(xué)派這樣把表演看作是唯一的。歐洲戲劇的發(fā)展規(guī)律是:時(shí)代的美學(xué)觀點(diǎn)支配著劇本寫(xiě)作形式,劇本寫(xiě)作形式又在主要地支配著表演形式;戲曲卻是:時(shí)代的美學(xué)觀點(diǎn)支配著表演形式,表演形式在主要地支配著劇本的寫(xiě)作形式?!盵1]
作為中國(guó)地方戲曲劇種之一的淮劇,同樣以表演藝術(shù)為中心與生命,各行當(dāng)均如此,旦角當(dāng)然亦如此。
然而,淮劇旦角表演藝術(shù)本身,又是一項(xiàng)全方位、系列化、深層次、高水準(zhǔn)的復(fù)雜系統(tǒng)工程,其中又以凸顯藝術(shù)特性為重點(diǎn)。因?yàn)樘匦宰鳛槭挛锾赜械男再|(zhì),屬于個(gè)性范疇,而一切藝術(shù)創(chuàng)造,重點(diǎn)也正在凸顯藝術(shù)個(gè)性。
具體來(lái)說(shuō),淮劇旦角表演藝術(shù)的特性,應(yīng)以戲曲特性、劇種特性、人物特性為重中之重。我們對(duì)此分別進(jìn)行研究與論述。
一、戲曲特性
淮劇旦角表演藝術(shù)的第一大特性,是戲曲特性。
中國(guó)戲曲的表演藝術(shù),與西方戲劇表演藝術(shù)的根本性區(qū)別,是藝術(shù)本質(zhì)與藝術(shù)風(fēng)格的寫(xiě)意性與寫(xiě)實(shí)性的區(qū)別?!皩?xiě)意是中國(guó)古代美學(xué)的一個(gè)重要命題,在戲曲表演藝術(shù)中主要表現(xiàn)為對(duì)時(shí)間空間限制的突破,以及動(dòng)作、布景的虛擬。合在一起,就造成了一個(gè)與實(shí)際的生活形態(tài)相去甚遠(yuǎn),藝術(shù)的韻律隨著心意流蕩的天地――當(dāng)然,不會(huì)是一個(gè)逼真的幻境?!盵2]
在寫(xiě)意的美學(xué)原則影響下,淮劇旦角的表演藝術(shù)與所有中國(guó)戲曲的所有行當(dāng)?shù)谋硌菟囆g(shù)一樣,都以虛擬化、夸張化、程式化、歌舞化為主要藝術(shù)特性。
從本質(zhì)上而言,寫(xiě)意特性就是民族特性的具體體現(xiàn)與張揚(yáng)。而民族特性又是世界上所有國(guó)家、所有民族的所有藝術(shù)的生命與靈魂。19世紀(jì)俄國(guó)著名作家赫爾岑指出:“詩(shī)人和藝術(shù)家們?cè)谒麄兊恼嬲淖髌分锌偸浅錆M(mǎn)民族性的?!盵3]民族文化是一個(gè)民族的精神支柱和血脈,是民族思想的堅(jiān)實(shí)根基。因此,淮劇旦角表演藝術(shù),要從這一思想高度來(lái)認(rèn)知并體現(xiàn)寫(xiě)意特性的神髓,要為弘揚(yáng)民族文化而寫(xiě)意,而不是只為寫(xiě)意而寫(xiě)意。戲曲特性的實(shí)質(zhì)就是民族特性。
二、劇種特性
淮劇旦角表演藝術(shù)的第二大特性,是劇種特性。
淮劇旦角表演,必須以淮劇本身的劇種特性為其題中應(yīng)有之義?;磩∽鳛槲覈?guó)地方戲曲劇種之一,“舊稱(chēng)‘淮海小戲’‘小戲’……(南派)就其聲腔的構(gòu)建而言,它是沿著【自由調(diào)】曲牌為主體加以延伸拓展,音樂(lè)語(yǔ)調(diào)又夾在江、浙一帶某些吳語(yǔ)語(yǔ)系的漩渦之中,故南派淮劇的音調(diào)多有富麗雕飾、精工細(xì)密的格調(diào)。北派是江蘇鹽阜、清、淮、寶及里下河廣闊地帶淮劇賴(lài)以生存的土家風(fēng)派。北派淮劇土俗意味濃郁,其聲腔多半是在【淮調(diào)】【拉調(diào)】曲牌的傳統(tǒng)音樂(lè)框架上作衍變,這就為此派淮劇的音調(diào)奠定了充滿(mǎn)田園野態(tài)、自然飄逸的情趣?;磩∈加谇迥?,以地?cái)傂问窖莩?,后逐漸發(fā)展為舞臺(tái)劇。曲調(diào)質(zhì)樸優(yōu)美,以‘拉魂腔’見(jiàn)長(zhǎng)。伴奏樂(lè)器以板制三弦為主,因而俗稱(chēng)‘三撥子’。劇目以反映民間生活的小戲?yàn)槎?,傳統(tǒng)戲有《打金枝》《孟麗君》《白虎堂》等?!盵4]后來(lái)又編演大量現(xiàn)代戲,并創(chuàng)造出【十里好風(fēng)光】等新曲調(diào)。
從本質(zhì)上說(shuō),劇種特性就是地域特性,而地域文化則是民族文化的重要組成部分,地域文化特性愈鮮明,民族文化特性也就愈濃郁。正因?yàn)槿绱?,魯迅先生指出:“有地方色彩的,倒容易成為世界的,即為別國(guó)所注意。打出世界上去,即于中國(guó)之活動(dòng)有利?!盵5]中國(guó)文學(xué)史與藝術(shù)史上成功的精品與經(jīng)典作品,無(wú)一不以鮮明的地域文化特色取勝,《詩(shī)經(jīng)》的黃河文化、《楚辭》的荊楚文化、《紅樓夢(mèng)》的京味兒、《金瓶梅》的魯味兒、老舍作品的京派文化、魯迅作品的海派文化……如此等等,不勝枚舉。
同樣,所有的中國(guó)地方戲曲劇種,無(wú)一不以各自獨(dú)有的地域文化特性為統(tǒng)領(lǐng),例如川劇的川文化特性、晉劇的晉文化特性、豫劇的豫文化特性、閩劇的閩文化特性、湘劇的湘文化特性、桂劇的桂文化特性、滇劇的滇文化特性、吉?jiǎng)〉募幕匦?、越劇的越文化特性、贛劇的贛文化特性……如此等等,俯拾即是。
因此,淮劇旦角表演藝術(shù),必須全力張揚(yáng)淮劇的地域文化特性,凸顯本劇種獨(dú)有的藝術(shù)特性。
三、人物特性
淮劇旦角表演藝術(shù)的第三大特性,是人物特性。
淮劇旦角主要包括青衣、花旦兩個(gè)行當(dāng)。青衣扮演莊重的中青年女性人物,重唱功,又稱(chēng)“正旦”;花旦扮演天真活潑或放浪潑辣的青年婦女,重做功與念白。此外,還有刀馬旦、武旦等。有些劇種,又將花旦細(xì)分為閨門(mén)旦、玩笑旦、刺殺旦、潑辣旦等等。
但是,所有這些行當(dāng)分工,都不能形成類(lèi)型化?;磩〉┙潜硌莸摹白罡呷蝿?wù)”,是在舞臺(tái)上塑造出生動(dòng)鮮活、個(gè)性鮮明的人物形象,是“演人不演行”,行當(dāng)與各種功法(主要是唱、念、做、打“四功”與手、眼、身、法、步“五法”)只是手段而非目的。因此,衡量一個(gè)演員的藝術(shù)水準(zhǔn),主要看他創(chuàng)造舞臺(tái)角色――人物形象的藝術(shù)能力。
在創(chuàng)造舞臺(tái)人物形象時(shí),重點(diǎn)是刻畫(huà)人物獨(dú)特的性格與特有的思想感情,做到傾情投入,做到以情帶聲、聲情并茂,做到以情動(dòng)人、以情感人。
有人說(shuō),“戲曲表演重形式輕體驗(yàn)”,其實(shí)這是一種誤解與誤判。中國(guó)戲曲表演從來(lái)都十分重視情感體驗(yàn),梅蘭芳大師說(shuō):“有人說(shuō),我在揪趙高胡子的時(shí)候,臉上好像笑又好像哭,問(wèn)我是怎么表演出來(lái)的。我在臺(tái)上演戲,無(wú)法看見(jiàn)那時(shí)候自己臉上的表情,這可能是因?yàn)槲倚睦锝豢椫鴥煞N極端矛盾的感情,一方面想用裝瘋逃避這險(xiǎn)惡的環(huán)境;同時(shí),把父親硬叫成‘兒子’也是極不愿意做的事情,所以不自覺(jué)地流露出這種似笑似哭的感情來(lái)?!盵6]
當(dāng)然,戲曲表演還要做到體驗(yàn)與表現(xiàn)的有機(jī)統(tǒng)一,完美結(jié)合,不僅要體驗(yàn)人物的內(nèi)心世界,而且還要?jiǎng)?chuàng)造出特定的外形予以表現(xiàn),做到內(nèi)部(心理)動(dòng)作與外部(形體)動(dòng)作的一體化。也就是說(shuō),要以人物情感統(tǒng)領(lǐng)各種舞臺(tái)動(dòng)作,將人物演活、演生動(dòng),演出特性來(lái),演出彩兒來(lái)。
當(dāng)然,要做到這一點(diǎn),絕非輕而易舉之事,必須刻苦鉆研角色,真正進(jìn)入到角色的內(nèi)心世界。還要苦練基本功,以精湛的技藝和才藝作為塑造舞臺(tái)人物形象的藝術(shù)憑借和智力支撐。
綜上所述,淮劇旦角表演藝術(shù)的特性,以戲曲特性、劇種特性、人物特性三大特性為重中之重,而這三大特性又是互相滲透、互相影響、互相促進(jìn)的三維互動(dòng)的,是相輔相成、相得益彰的。
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一、研究介紹
筆者隨機(jī)選取了數(shù)所幼兒園大、中、小班各年齡段的幼兒作為研究對(duì)象。在幼兒表演、教師單純講課、師幼互動(dòng)、幼兒自主活動(dòng)時(shí),研究者若發(fā)現(xiàn)研究對(duì)象有干擾他人、交頭接耳、做小動(dòng)作、呆坐、東張西望、出怪聲、走動(dòng)等注意力分散行為時(shí),就立即進(jìn)行詳細(xì)記錄,包括行為發(fā)生的背景、發(fā)生的原因、行為的變化、行為的終止與結(jié)果等。
二、研究結(jié)果與分析
1.幼兒注意力分散的行為表現(xiàn)
調(diào)查數(shù)據(jù)顯示,幼兒注意力分散的行為表現(xiàn)是多種多樣的,其中,做小動(dòng)作是幼兒最容易出現(xiàn)的注意力分散類(lèi)型,大多數(shù)幼兒在課堂上都有玩衣服上的紐扣、帶有彩燈的鞋等小動(dòng)作。這表明,幼兒注意力集中的程度很低。觀察中還發(fā)現(xiàn),當(dāng)幼兒出現(xiàn)注意力分散行為時(shí),鄰座的幼兒很容易受其影響。如有幼兒帶來(lái)了卡通貼畫(huà),鄰座的幼兒就可能和他一起看貼畫(huà)、分貼畫(huà)、搶貼畫(huà)、貼貼畫(huà)。
2.幼兒在什么樣的活動(dòng)中容易注意力分散
調(diào)查顯示,幼兒在進(jìn)行師幼互動(dòng)時(shí)最容易注意力分散。教師在提問(wèn)時(shí),有的幼兒在拉其他幼兒的衣服,跟其他幼兒說(shuō)話(huà);在朗讀環(huán)節(jié),有的幼兒東張西望,有的幼兒在翻看其他頁(yè)。幼兒自主閱讀和教師單純講授的過(guò)程中,幼兒出現(xiàn)注意力分散的次數(shù)也較多,主要表現(xiàn)為呆坐和干擾他人。在幼兒上臺(tái)表演期間,留在座位上的幼兒容易注意力分散。
3.教師對(duì)幼兒注意力分散行為的處理
幼兒出現(xiàn)注意力分散行為之后,不同老師的關(guān)注程度及采取的辦法不盡相同。從統(tǒng)計(jì)圖可以看出,幼兒出現(xiàn)注意力分散行為后多依靠自主恢復(fù),也就是幼兒自己玩一會(huì)兒之后會(huì)覺(jué)得沒(méi)意思了,便會(huì)停止注意力分散行為。相對(duì)而言,教師主動(dòng)引導(dǎo)的比例不高,部分教師看到幼兒出現(xiàn)溜號(hào)時(shí)甚至不予理睬。
4.幼兒注意力分散行為的性別差異
研究表明,在出現(xiàn)注意力分散行為的孩子中,男孩的比例(占55.9%)要比女孩的比例(占44.1%)高。據(jù)觀察顯示,男孩的注意力分散行為多表現(xiàn)為左顧右盼和干擾他人,而女孩則表現(xiàn)為做小動(dòng)作和呆坐。
三、教育建議
幼兒時(shí)期是注意力發(fā)展的敏感時(shí)期。教師應(yīng)結(jié)合幼兒不同年齡段的特點(diǎn),在實(shí)施各種活動(dòng)時(shí),科學(xué)設(shè)計(jì)活動(dòng),注重教學(xué)策略,使幼兒注意力能夠集中。
1.把握教學(xué)時(shí)間,延長(zhǎng)幼兒有意注意的時(shí)長(zhǎng)
小班幼兒一般只能穩(wěn)定地集中注意力3~5分鐘,中班幼兒可達(dá)10分鐘,大班幼兒可達(dá)15分鐘。幼兒教師應(yīng)根據(jù)幼兒不同的年齡段,把握好教學(xué)時(shí)間,注重教學(xué)效率。
2.教師應(yīng)給予每個(gè)幼兒足夠的關(guān)注
觀察中發(fā)現(xiàn),那些坐在角落或者位置靠邊的幼兒出現(xiàn)注意力分散的情況最多。教師應(yīng)對(duì)這些幼兒給予較多的關(guān)注,并加以引導(dǎo)。同時(shí),教師要關(guān)注晨檢環(huán)節(jié),對(duì)幼兒自帶新奇小玩具、小卡片、小亮片等行為加以限制,必要時(shí)可代為保管這些物品。這樣,可避免幼兒受到物品的干擾和刺激而導(dǎo)致注意力分散,也可適當(dāng)減少安全隱患。
3.善于拋出問(wèn)題,獲得積極回應(yīng)
教師應(yīng)以參與者的身份,努力為幼兒營(yíng)造一個(gè)有趣、輕松的課堂環(huán)境。在各類(lèi)的活動(dòng)中,教師要避免直接給幼兒提供正確的答案,應(yīng)增強(qiáng)活動(dòng)的趣味性,善于創(chuàng)設(shè)問(wèn)題情境,多采用提問(wèn)的形式,鼓勵(lì)幼兒假設(shè)與猜想,讓幼兒自主選擇,積極融入活動(dòng)之中。
4.避免過(guò)多地打擾幼兒
在幼兒集中注意力從事某項(xiàng)有意義的活動(dòng)時(shí),教師應(yīng)注意調(diào)整自己的言行舉止,避免打擾幼兒,分散他們的注意力。如幼兒集中注意力畫(huà)畫(huà)時(shí),教師應(yīng)給予幼兒足夠的空間和時(shí)間,讓他們自主地去想象、探究、發(fā)現(xiàn),而不能過(guò)多地邊走邊講或干涉某個(gè)幼兒,影響他們的思路。
5.科學(xué)提供對(duì)幼兒有意義、使幼兒感興趣的材料
教師為幼兒提供適宜、適量、美觀、隱含教育價(jià)值的材料,可以讓他們通過(guò)操作材料獲得情感、認(rèn)知和技能等方面的發(fā)展,但材料的投放應(yīng)注意其中的教育因素。比如,在建構(gòu)活動(dòng)中,如果投放的材料太少,孩子不僅不能滿(mǎn)足完整拼搭某種物體的愿望,還可能因?yàn)閾?dān)心自己僅有的積木被別人搶去,而把注意力轉(zhuǎn)移到如何保護(hù)自己的材料上。而如果投放的材料太多,則會(huì)讓孩子們無(wú)所適從,他們一會(huì)兒玩玩這個(gè),一會(huì)兒碰碰那個(gè),根本無(wú)法注意力集中地進(jìn)行某項(xiàng)工作。一般而言,幼兒年齡越小,投放的活動(dòng)材料的品種應(yīng)越少,但單類(lèi)材料的數(shù)量應(yīng)適當(dāng)多一些;材料需周期性地加以豐富和更新;準(zhǔn)備的材料給予孩子創(chuàng)造的空間越大,孩子玩的興趣就越大,注意力也就越集中。
6.教師在講課時(shí)應(yīng)注意音調(diào)的變化和音量的調(diào)節(jié)
教師在活動(dòng)組織的環(huán)節(jié)中,應(yīng)避免出現(xiàn)平淡、無(wú)變化的語(yǔ)音、語(yǔ)調(diào),因?yàn)閱握{(diào)的聲音容易使人昏昏欲睡。為此,在進(jìn)行講述時(shí),教師可結(jié)合講述內(nèi)容不斷變化語(yǔ)音、語(yǔ)調(diào),甚至可以模仿各種小動(dòng)物的聲音,并加上肢體動(dòng)作,生動(dòng)有趣地組織活動(dòng),吸引幼兒積極參與。
【摘要】
目的:比較三種不同熒光標(biāo)記的短雙鏈RNA(siRNA)體外轉(zhuǎn)染特性. 方法:利用脂質(zhì)體LipofectamieTM2000轉(zhuǎn)染三種熒光標(biāo)記siRNA入小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系NIH 3T3,流式細(xì)胞儀觀察轉(zhuǎn)染效率,普通倒置熒光顯微鏡觀察其淬滅情況,激光共聚焦顯微鏡觀察其在細(xì)胞內(nèi)的分布情況. 結(jié)果:相同轉(zhuǎn)染條件下三種熒光siRNA進(jìn)入細(xì)胞的速度,細(xì)胞內(nèi)的定位不同,轉(zhuǎn)染效率不同,三種熒光標(biāo)記的抗淬滅能力也不同. 結(jié)論:熒光標(biāo)記siRNA可以起到良好的示蹤作用. 用熒光標(biāo)記siRNA作為無(wú)熒光siRNA的分布和轉(zhuǎn)染效率參照時(shí),要考慮到所選用熒光標(biāo)記siRNA與無(wú)熒光標(biāo)記siRNA的差異.
【關(guān)鍵詞】 熒光標(biāo)記;siRNA;轉(zhuǎn)染
【Abstract】 AIM: To compare the transfection character of three different fluorescently labeled small interfering RNA (siRNA) in vitro. METHODS: Three fluorescently labeled siRNA were transfected with LipofectamieTM2000 into NIH 3T3 cells for monitoring their transfection efficiency with flow cytometry, tracking their delivery with confocal microscopy and checking their photostability with fluorescent microscope. RESULTS: These three fluorescently labeled siRNA varied in intracellular distribution, transfection efficiency and quench speed. CONCLUSION: The fluorescence labeled siRNA helps to tracking the delivery of siRNA in cells. The difference between fluorescently labeled siRNA and unlabeled siRNA should be considered when the fluorescently labeled siRNA is used to study the distribution and transfection efficiency of siRNA.
【Keywords】 fluorescence label;small interfering RNA;transfection
0 引言
化學(xué)合成的siRNA可以高效特異地抑制靶基因的表達(dá),不僅是分析基因功能的有力工具且有望成為新型藥物[1],但遞送效率低和體內(nèi)有效性問(wèn)題仍然是其應(yīng)用的瓶頸,因此,深入研究其在體內(nèi)的分布和動(dòng)力學(xué)過(guò)程已逐步受到重視[2]. 利用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀、激光共聚焦顯微鏡等方法檢測(cè)熒光標(biāo)記siRNA[3],觀察其攝取、分布及代謝情況,借以推斷無(wú)熒光標(biāo)記siRNA的轉(zhuǎn)染效率和分布. 然而目前雖有多種商品化無(wú)沉默效應(yīng)的熒光標(biāo)記siRNA可供選擇,但它們的分布和轉(zhuǎn)染效率是否一致尚少見(jiàn)報(bào)道. 本研究比較三種常用熒光標(biāo)記siRNA利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染時(shí)轉(zhuǎn)染效率、熒光淬滅情況和細(xì)胞內(nèi)分布特點(diǎn),以探討應(yīng)用熒光標(biāo)記siRNA時(shí)需注意的問(wèn)題.
1 材料和方法
1.1 材料
三種熒光siRNA分別為:BLOCKiTTM熒光寡聚物(序列未公開(kāi))購(gòu)自Invitrogen公司;FAM notarget siRNA(正義鏈5′UUCUCCGAACGUGUCACGU3′,F(xiàn)AM標(biāo)記于5′端)購(gòu)自廣州銳博公司;Alexa Fluor 546陰性對(duì)照siRNA(靶序列 5′AATTCTCCGAACGTGTCACGT3′,正義鏈3′端3標(biāo)記Alexa Fluor 546)購(gòu)自Qiagen公司. 前兩種為即用型,后一種按照說(shuō)明書(shū)方法加入退火緩沖液,90℃變性并退火,分裝后避光保存于-20℃. 三種熒光siRNA的儲(chǔ)備液濃度均為20 μmol/L. 小鼠胚胎纖維細(xì)胞系NIH3T3由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心細(xì)胞庫(kù)凍存;高糖DMEM培養(yǎng)基和DPBS購(gòu)自Gibco BRL公司;胎牛血清購(gòu)自杭州四季青工程材料研究所;脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000,OptiMEM低血清培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司;Hochest33342購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,其他生化試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?
1.2 方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
NIH3T3細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含100 mL/L胎牛血清無(wú)抗生素高糖DMEM培養(yǎng)基,每孔4×104個(gè)細(xì)胞接種24孔板,24 h后細(xì)胞的匯合度達(dá)40%. 用LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染熒光siRNA,按照說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行. 不同濃度轉(zhuǎn)染效率時(shí)siRNA各組終濃度分別為0.5,5,40,120 nmol/L,LipofectamineTM 2000均為1 μL. siRNA進(jìn)入細(xì)胞速度時(shí)轉(zhuǎn)染復(fù)合物孵育時(shí)間分別為1,2,4,6和24 h,siRNA濃度均為40 nmol/L,每組不同時(shí)間重復(fù)3次;觀察淬滅情況和共聚焦觀察細(xì)胞內(nèi)分布時(shí)采用40 nmol/L,觀察時(shí)間為4 h.
1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)
熒光siRNA轉(zhuǎn)染效率各組細(xì)胞用DPBS沖洗2次,0.25 g/L胰蛋白酶消化,用DPBS制成150 μL單細(xì)胞懸液,冰上運(yùn)輸,BD FACSAria流式細(xì)胞儀檢測(cè),CellQuest軟件記錄分析.
1.2.3 普通熒光顯微鏡觀察淬滅情況和細(xì)胞內(nèi)分布模式
轉(zhuǎn)染后6 h后將24孔板直接置于倒置熒光顯微鏡(Leica DMIRE)載物臺(tái)上觀察,cold CCD數(shù)碼相機(jī)Leica Qwin軟件照相. 拍第一張照片時(shí)間記為0 min,分別于3 min和5 min后不改動(dòng)成像參數(shù)同一位置再拍攝兩張,觀察熒光淬滅情況.
1.2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察[4]細(xì)胞鋪板時(shí)24孔板中放滅菌圓形蓋玻片,轉(zhuǎn)染后6 h培養(yǎng)液中加入Hoechst 33342(終濃度5 mg/L)孵育10 min染核,用DPBS洗3遍后,取出爬片,-20℃預(yù)冷丙酮固定10 min,PBS洗3遍,抗淬滅水性封片劑封片. Zeiss LSM 510 META共聚焦顯微鏡40倍物鏡下觀察,BLOCKiTTM熒光寡聚物和FAM notarget siRNA使用488 nm激發(fā)光和515~540 nm濾片檢測(cè);Alexa Fluor 546陰性對(duì)照siRNA使用568 nm激發(fā)光和575~640 nm檢測(cè)濾片.
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理: 采用SPSS 13. 0統(tǒng)計(jì)軟件處理,χ2分析轉(zhuǎn)染效率差異,P
2 結(jié)果
2.1 FCM檢測(cè)熒光siRNA轉(zhuǎn)染效率
每一樣品收集2×104個(gè)細(xì)胞,設(shè)定一個(gè)單細(xì)胞區(qū)域P1用于熒光分析. 以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為空白對(duì)照,設(shè)定陽(yáng)性細(xì)胞區(qū)(P2區(qū))使陰性對(duì)照P區(qū)細(xì)胞數(shù)不超過(guò)0.1%(圖1A). 40 nmol/L siRNA轉(zhuǎn)染4 h時(shí)轉(zhuǎn)染效率Alexa Fluor 546陰性對(duì)照siRNA的轉(zhuǎn)染效率為(62.7±2.4)%, BLOCKiTTM熒光寡聚物的轉(zhuǎn)染效率為(85.1±5.2)%, FAM notarget siRNA的轉(zhuǎn)染效率為(69.4±3.6)%. χ2分析示Alexa Fluor 546陰性對(duì)照siRNA的轉(zhuǎn)染效率顯著低于BLOCKiTTM熒光寡聚物(P=0.037),BLOCKiTTM熒光寡聚物的轉(zhuǎn)染效率顯著高于FAM notarget siRNA的轉(zhuǎn)染效率(P=0.017),Alexa Fluor 546陰性對(duì)照siRNA的轉(zhuǎn)染效率低于FAM notarget siRNA BLOCKiTTM熒光寡聚物(P=0.000). 隨著siRNA濃度增加(圖1B)和轉(zhuǎn)染復(fù)合物孵育時(shí)間延長(zhǎng)(圖1C),三種熒光標(biāo)記siRNA的轉(zhuǎn)染效率增加, 6 h和24 h轉(zhuǎn)染效率相差不大, 唯FAM notarget siRNA 24 h轉(zhuǎn)染效率為(59.3±2.5)%. BLOCKiTTM熒光寡聚物在0.5 nmol/L和5 nmol/L濃度時(shí),轉(zhuǎn)染效率就達(dá)FAMsiRNA (27.9±2.5)%和(77.3±3.7)%,孵育1 h和2 h轉(zhuǎn)染效率達(dá)(54.1±4.9)%和(78.2±3.6)%,高于其它兩種(P=0.000).
2.2 普通熒光顯微鏡觀察淬滅情況和細(xì)胞內(nèi)分布模式
三種熒光siRNA在普通熒光顯微鏡下的熒光模式不同. Alexa Fluor 546陰性對(duì)照siRNA傾向于以較大顆粒分布在核周胞漿內(nèi)(圖2A, B, C, D);BLOCKiTTM熒光寡聚物胞漿、胞核中都有,在胞核中的熒光強(qiáng)度很高(圖2E, F, G, H);FAM notarget siRNA為細(xì)小點(diǎn)狀熒光信號(hào),分布于胞漿和胞核中(圖2I, J, K, L). 用熒光顯微鏡照射3 min(圖2C, G, K)和5 min(圖2D, H, L)發(fā)現(xiàn)Alexa Fluor 546陰性對(duì)照siRNA抗淬滅能力最高,BLOCKiTTM熒光寡聚物居中,F(xiàn)AM notarget siRNA最低,3 min已幾乎完全淬滅. BLOCKiTTM熒光寡聚物胞漿中的熒光信號(hào)先淬滅,而后是胞核中的. 無(wú)siRNA只加LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑的細(xì)胞未見(jiàn)熒光(結(jié)果未顯示).
2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察三種熒光siRNA細(xì)胞內(nèi)定位40 nmol/L各種siRNA轉(zhuǎn)染后4 h,Alexa Fluor 546陰性對(duì)照siRNA為點(diǎn)狀的熒光,多數(shù)位于近核胞漿中(圖3A,D);BLOCKiTTM熒光寡聚物(圖3B,E)和FAM notarget siRNA(圖3C,F(xiàn))的模式相似,在核內(nèi)和胞漿中都可見(jiàn),部分呈熒光顆粒.
3 討論
脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染是體外導(dǎo)入化學(xué)合成siRNA的標(biāo)準(zhǔn)方法,siRNA體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)報(bào)道中使用最多的轉(zhuǎn)染試劑是LipofectamineTM 2000,對(duì)許多細(xì)胞可以獲得很高的轉(zhuǎn)染效率和基因沉默效率[3],所以本研究也選用該試劑作為轉(zhuǎn)染試劑比較三種熒光標(biāo)記siRNA的體外轉(zhuǎn)染特性.
本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在相同的轉(zhuǎn)染條件下,三種熒光siRNA的轉(zhuǎn)染效率不同;BLOCKiTTM熒光寡聚物更易進(jìn)入細(xì)胞,原因可能因?yàn)樗暮颂枪羌芙?jīng)過(guò)磷硫?;揎棧?],所以其進(jìn)入細(xì)胞的速度明顯增加. 轉(zhuǎn)染6 h和24 h的效率相差不大,可見(jiàn)LipofectamineTM 2000推薦4 h和6 h更換轉(zhuǎn)染復(fù)合物比較合理,但注意到Alexa Fluor 546陰性對(duì)照siRNA 4 h和6 h的轉(zhuǎn)染效率相差仍比較明顯,所以6 h更換轉(zhuǎn)染復(fù)合物更加合適. FAM notarget siRNA 24 h轉(zhuǎn)染效率降低為59.3%,原因可能是熒光素淬滅而非轉(zhuǎn)染效率低.
關(guān)于淬滅情況:標(biāo)記siRNA的熒光物質(zhì)有許多種,最早有熒光素(fluorescein,F(xiàn)AM),后來(lái)的藻紅素(cy系列),alexa系列的熒光穩(wěn)定性和可選擇波長(zhǎng)更進(jìn)了一步. 本研究三種熒光siRNA中熒光素FAM notarget siRNA采用的是FAM標(biāo)記,BLOCKiTTM熒光寡聚物采用的FITC,似乎都為熒光素,但后者經(jīng)磷硫?;揎?,穩(wěn)定性增強(qiáng),所以其抗淬滅能力也有所增強(qiáng). Alexa Fluor 546陰性對(duì)照siRNA采用的是Alexa fluor546,其中Alexa fluor546標(biāo)記的siRNA的抗淬滅能力最強(qiáng).
關(guān)于細(xì)胞內(nèi)的定位:脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染情況下,siRNA脂質(zhì)體復(fù)合物首先沉積并粘附于細(xì)胞表面,然后通過(guò)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞形成內(nèi)含體,在胞漿中通過(guò)動(dòng)力蛋白驅(qū)動(dòng)定向運(yùn)送到核周區(qū),并迅速在核周區(qū)聚集[6], 最后siRNA從脂質(zhì)體復(fù)合物中釋放出來(lái)才能發(fā)揮作用. 本研究中用共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)Alexa Fluor 546陰性對(duì)照siRNA幾乎只以顆粒狀分布于近核胞漿中,與Chiu等[3]報(bào)道的用LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染cy3標(biāo)記的siRNA結(jié)果一致,而B(niǎo)LOCKiTTM熒光寡聚物和FAM notarget siRNA在核內(nèi)和胞漿中都有,在胞漿中核周區(qū)可見(jiàn)大的熒光顆粒. 其中BLOCKiTTM熒光寡聚物的核定位考慮與其磷硫酰化修飾有關(guān),而FAM notarget siRNA為正義鏈5′標(biāo)記,其核定位可能為與其復(fù)合物中混合有單鏈siRNA有關(guān). Ohrt等[7]顯微注射熒光標(biāo)記的siRNA入Hela細(xì)胞的胞漿中,發(fā)現(xiàn)雙鏈siRNA不能進(jìn)入細(xì)胞核,而單鏈siRNA有明顯聚集于核內(nèi)的傾向. 而Alexa Fluor 546陰性對(duì)照siRNA未于見(jiàn)核中可能因?yàn)閟iRNA還未從脂質(zhì)體復(fù)合物中釋放. 而siRNA從復(fù)合物中釋放是與基因沉默效果相關(guān)的,是否說(shuō)明熒光標(biāo)記影響基因沉默效果還有待分析.
綜上所述,選取合適的熒光標(biāo)記siRNA作為轉(zhuǎn)染效率評(píng)估指標(biāo)和用于細(xì)胞內(nèi)分布研究時(shí),要注意熒光標(biāo)記物對(duì)siRNA的影響,以及靶向目的基因的siRNA與所選用熒光標(biāo)記的對(duì)照siRNA在化學(xué)修飾等因素方面的相似性.
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